用接着周波数アッセイその場で速度論解析
Summary
両分子が相互作用する細胞の表面上に固定されているときに受容体 – リガンド相互作用の動力学を測定するための接着の周波数分析が記載されている。この機械的にベースのアッセイは、相互作用する受容体とリガンドと密着センサーとインテグリンαLβ2と細胞間接着分子-1のようなマイクロピペット、加圧されたヒト赤血球を用いて例示される。
Abstract
マイクロピペットの接着アッセイは、2次元（2D）受容体-リガンド結合速度1を測定するために、1998年に開発されました。アッセイは接着センサーと相互作用する分子のいずれかの提示細胞としてのヒト赤血球（RBC）を使用しています。それは正確に制御領域との結合形成を可能にするための時間と他の相互作用する分子を発現し、他の細胞と接触RBCを持って来るためにマイクロマニピュレーションを採用しています。接着イベントは離れた二つのセルを引っ張って上RBCの伸長として検出されます。赤血球表面上に固定化されたリガンドの密度を制御することにより、密着性の確率は0と1の間のミッドレンジ内に保持されます。付着確率は、所定の接触時間の2つの細胞間の繰り返し接触サイクルの順序で接着事象の頻度から推定される。接触時間を変化させることで結合曲線を生成します。結合する受容体-リガンドの反応速度論1の確率モデルのフィット曲線は、2次元親和性とオフレートを返します。
アッセイは、IgGのFc 1-6、複合糖質リガンド6-9、配位子10-13、homotypicalカドヘリン結合14、ペプチド-主要組織適合遺伝子複合体15とT細胞受容体とレセプターとのインテグリンとセレクチンとのFcγ受容体の相互作用を用いて検証されています– 19。
メソッドは、このような膜microtopology 5、膜アンカー2、分子配向と長さ6、キャリアの剛性9曲20、インピンジメント力20、ならびに生化学的要因として生物物理学的な要因によって2D速度の規制を定量化するために使用されていますこのような相互作用する分子が存在し、これらの分子15,17,19の表面の組織細胞骨格と膜の微小環境の変調器として。
方法は、tをも使用されていますOは、修正モデル21を使用してデュアル受容体-リガンドの種3,4の同時結合、および19 trimolecular相互作用を研究する。
法の大きな長所は、それが彼らのネイティブな膜環境での受容体の研究をできることです。結果は、精製された受容体17を用いて得られたものとは大きく異なる可能性があります。また、よく典型的な生化学的方法を超えて時間分解能を持つサブ秒の時間スケールにおける受容体 – リガンド相互作用の研究が可能になります。
マイクロピペットの接着周波数の方式を説明するために、我々はαLβ2をアクティブにするために溶液中で二量体のE -セレクチンと好中球上のインテグリンαLβ2に結合赤血球の官能細胞間接着分子1（ICAM – 1）の動態の測定を示す。
Protocol
1。全血から赤血球を分離 EAS – 45溶液を調製。 表Iからすべての成分を秤量し、純水の100〜200ミリリットルに溶解する。千ミリリットルソリューションを作成し、pHを8.0に調整するために水を加えます。 50ミリリットルでフィルタと注し。ストレージ用に-20℃で凍結する。 注：ステップ1.2は、プロトコルを承認された治験審査委員会で、このよう?…
Discussion
首尾よく、いくつかの重要なステップを考慮する必要がありますマイクロ接着周波数アッセイを使用する。最初に、興味の受容体 – リガンドシステムのための特異的相互作用を記録することを確認してください。非特異的コントロールの測定値（図3参照、4）特異性を確認してください。理想的には、非特異的付着確率は、すべての接触の継続時間を0.05未満である必要がありますし、各時点?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIHの助成金R01HL091020、R01HL093723、R01AI077343、およびR01GM096187によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Scientific | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Immunocytometry Systems | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Glass Inc. | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piezoelectric translator | Physik Instrumente | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetics Systems | 5200 Series | Micropipette system |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Zarnitsyna, V. I., Zhu, C. Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface. J. Vis. Exp. (57), e3519, doi:10.3791/3519 (2011).