JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서 속도론 해석

Published: November 02, 2011
doi:
10.3791/3519
,
1Biomedical Engineering Department,Georgia Institute of Technology

Summary

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 – 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette – 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 – 1을 사용하여 exemplified입니다.

Abstract

micropipette 부착 분석은 2 차원 (2D) 수용체 – 리간드 바인딩 속도론 1 측정하기 위해 1998 년에 개발되었습니다. 분석은 부착 센서와 상호 작용하는 분자 중 하나를 제시 세포로 인간의 적혈구 (RBC)를 사용합니다. 그것은 정확하게 제어 영역과 결합 형성을 활성화하기 위해 시간과 다른 상호 작용하는 분자를 표현 다른 세포와 접촉에 RBC를 가지고 미세 조작을 사용합니다. 접착 이벤트가 떨어져 두 세포를 당기시 RBC의 신장으로 감지됩니다. RBC 표면에 고정화 리간드의 밀도를 조절하여 접착의 확률은 0과 1 사이의 미드 레인지에 보관됩니다. 유착 확률은 주어진 접촉 시간이 두 세포 사이의 접촉 반복주기의 순서에 유착 사건의 주파수 추정된다. 연락처 시간을 변화하는 것은 바인딩 커브를 생성합니다. 바인딩 수용체 – 리간드 반응 속도론 1 확률적 모델 피팅곡선은 2D 친화력과 오프 속도를 반환합니다.

분석은 IgG FC 1-6 glycoconjugate 리간드 6-9, 리간드 10-13, homotypical cadherin 구속력이 14 펩타이드 – 주요 histocompatibility의 단지 15 T 세포 수용체와 coreceptor과 integrins와 selectins과 Fcγ 수용체의 상호 작용을 사용하여 검증되었습니다 – 19.

방법은, 같은 멤브레인 microtopology 5, 멤브레인 앵커 2, 분자 오리 엔테이션 및 길이 6, 캐리어 강성 9, 곡률 20과 충돌 힘 20,뿐만 아니라 생화 학적 요인 biophysical 요소에 의해 2D 속도론의 규정을 계량하는 데 사용되었습니다 상호 작용하는 분자가있는 cytoskeleton과 멤브레인 microenvironment하고 이러한 분자 15,17,19의 표면 조직의 모듈 레이터 등.

방법은 t에도 사용되고 있습니다O는 수정된 모델 21를 사용하여 이중 수용체 – 리간드 종 3,4의 동시 구속, 19 trimolecular 상호 작용을 공부합니다.

방법의 주요 장점은 자신의 기본 멤브레인 환경에서 수용체 연구를 허용한다는 것입니다. 결과는 정화 수용체 17를 사용하여 얻은 이들의 매우 다른 수 있습니다. 또한 잘 전형적인 생화학 방법을 넘어 시간적 해상도를 가진 하위 초 timescale에있는 수용체 – 리간드 상호 작용의 연구를 수 있습니다.

micropipette 부착 주파수 방법을 설명하기 위해, 우리는 α L의 β 2 활성화 솔루션에 dimeric E – selectin과 neutrophils에서 인테 그린 α L의 β 2 구속력 RBCs에 작용 세포 유착 분자 1 (ICAM – 1)의 속도론 측정을 보여줍니다.

Protocol

1. 전체 혈액에서 RBCs 절연 EAS – 45 솔루션을 준비합니다. 테이블 내의 모든 재료를 무게 및 DI 워터 100 – 200ml에 용해. 1000ml 솔루션을 만들고 8.0 산도를 조정하기 위해 물을 추가합니다. 50ml에 의해 필터 나누어지는. 스토리지 -20 ° C에서 고정. 참고 : 단계 1.0 기관 검토위원회 승인을 프로토콜과 함께 간호사로 훈련 의료 전문가 등에 의해 수행되어야합?…

Discussion

성공적으로 한 몇 가지 중요한 단계를 고려해야합니다 micropipette 부착 주파수 분석을 사용합니다. 첫째, 관심의 수용체 – 리간드 시스템의 구체적인 상호 작용을 기록해야합니다. 특이 현상이 제어 측정 (그림 참조하라. 3, 4)는 특이성을 보장합니다. 이상적으로, 특이 현상이 부착 확률은 접촉 시간에 대한 기간이 0.05 이하이어야하며 각 시점에 대한 구체적이고 특이 현상이 부착 확률 사이의 상당?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 NIH 보조금 R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 및 R01GM096187 지원했다.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue # Comments
10x PBS BioWhittaker

17-517Q

 Dilute to 1x with deionized water prior to use
Vacutainer EDTA BD 366643 RBCs isolation
10ML PK100      
Histopaque 1077 Sigma-Aldrich 10771 RBCs isolation
Adenine Sigma-Aldrich A2786 EAS-45 preparation
D-glucose (dextrose) Sigma-Aldrich G7528 EAS-45 preparation
D-Mannitol Sigma-Aldrich 6360 EAS-45 preparation
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 EAS-45 preparation
Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) Fisher Scientific S374 EAS-45 preparation
L-glutamine Sigma-Aldrich G5763 EAS-45 preparation
Biotin-X-NHS Calbiochem 203188 RBCs biotinylation
Dimethylformamide (DMF) Thermo Scientific 20673 RBCs biotinylation
Borate Buffer (0.1M) Electron Microscopy Sciences 11455-90 RBCs biotinylation
Streptavidin Thermo Scientific 21125 Ligand functionalizing
BSA Sigma-Aldrich A0336 Ligand functionalizing
Quantibrite PE Beads BD Biosciences 340495 Density quantification
Flow cytometer BD Immunocytometry Systems

BD LSR II

 Density quantification

Capillary Tube

0.7-1.0mm x 30"		 Kimble Glass Inc. 46485-1 Micropipette pulling
Mineral Oil Fisher Scientific BP2629-1 Chamber assembly
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-544-G Chamber assembly

PE α-human CD11a

Clone HI 111 		eBioscience 12-0119-71 Reagent for Fig.1
PE anti-human CD54 eBioscience 12-0549 Reagent for Fig.1
Mouse IgG1 Isotype Control PE eBioscience 12-4714 Reagent for Fig.1
hydraulic micromanipulator Narishige MO-303 Micropipette system
Mechanical manipulator Newport 461-xyz-m, SM-13, DM-13 Micropipette system
piezoelectric translator Physik Instrumente P-840 Micropipette system
LabVIEW National Instruments Version 8.6 Micropipette system
DAQ board National Instruments USB-6008 Micropipette system
Optical table Kinetics Systems 5200 Series Micropipette system
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
  2. Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
  3. Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
  4. Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
  5. Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
  6. Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
  7. Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
  8. Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
  9. Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
  10. Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
  11. Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
  12. Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
  13. Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
  14. Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
  15. Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
  16. Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
  17. Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 .
  18. Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
  19. Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
  20. Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
  21. Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
  22. Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
  23. Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
  24. Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
  25. Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
  26. Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
  27. Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
  28. Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
  29. Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
  30. Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
  31. Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
  32. Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
  33. Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).

Tags

Adhesion Frequency AssayIn Situ Kinetics AnalysisCross-junctional Molecular InteractionsCell-cell InterfaceMicropipette Adhesion AssayReceptor-ligand Binding KineticsHuman Red Blood Cell (RBC)MicromanipulationBond FormationAdhesion EventRBC ElongationLigands ImmobilizedAdhesion ProbabilityBinding CurveProbabilistic ModelReceptor-ligand Reaction Kinetics2D AffinityOff-rateFcγ ReceptorsIgG Fc1-6SelectinsGlycoconjugate LigandsIntegrinsHomotypical Cadherin BindingT Cell ReceptorCoreceptorPeptide-major Histocompatibility Complexes
check_url/it/3519?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Zarnitsyna, V. I., Zhu, C. Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface. J. Vis. Exp. (57), e3519, doi:10.3791/3519 (2011).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image