Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

Summary

Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

Abstract

O ensaio de adesão micropipeta foi desenvolvido em 1998 para medir a duas dimensões (2D) receptor-ligante cinética de ligação ^1. O ensaio utiliza uma célula vermelha do sangue humano (RBC) como sensor de adesão e apresentar célula de uma das moléculas que interagem. Ela emprega micromanipulação para trazer o RBC em contato com outra célula que expressa a molécula de interagir com outras área controlada com precisão e tempo para permitir a formação de vínculo. O evento de adesão é detectado como alongamento RBC em cima puxando as duas células separadas. Ao controlar a densidade dos ligantes imobilizados na superfície RBC, a probabilidade de adesão é mantido em mid-range entre 0 e 1. A probabilidade de adesão é estimada a partir da freqüência de eventos de aderência em uma seqüência de ciclos de repetição do contato entre as duas células de um determinado tempo de contato. Variando o tempo de contato gera uma curva de ligação. Montagem de um modelo probabilístico para o receptor-ligante reação cinética de ¹ a a ligaçãocurva retorna a afinidade 2D e desconto na tarifa.

O teste foi validado usando interações de receptores Fcγ com IgG Fc ^1-6, selectinas com ligantes glicoconjugada ^6-9, integrinas com ligantes ^10-13, homotypical caderina vinculativo ^14, T receptor celular e co-receptor com complexos peptídeo-major de histocompatibilidade ^{15 – 19.}

O método tem sido utilizado para quantificar os regulamentos da cinética 2D por fatores biofísicos, tais como a membrana microtopology ^5, membrana âncora ^2, orientação molecular e comprimento ^6, rigidez transportadora ^{9, 20} curvatura, e força impingement ^20, bem como os fatores bioquímicos, tais como moduladores do microambiente citoesqueleto e membrana onde as moléculas interagem e reside na organização superfície dessas moléculas ^15,17,19.

O método também foi usado to estudo a ligação simultânea de dupla receptor-ligante ^3,4 espécies e interações trimolecular ¹⁹ usando um modelo modificado ^21.

A principal vantagem do método é que ele permite estudo de receptores de membrana em seu ambiente nativo. Os resultados poderiam ser muito diferentes daqueles obtidos com receptores purificada ^17. Ele também permite estudo das interações receptor-ligante em uma escala de tempo sub-segundo, com resolução temporal muito além dos métodos típicos bioquímicos.

Para ilustrar o método de freqüência de adesão micropipeta, mostramos a cinética de medição da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) em hemácias funcionalizados ligação a integrina β α _{L 2} em neutrófilos com dimérica E-selectina na solução para ativar α β _{L 2.}

Protocol

1. RBCs isolamento do sangue total Prepare EAS-45 soluções. Pesar até todos os ingredientes da Tabela I e dissolver em 100-200ml de água DI. Adicionar água para fazer a solução de 1000ml e ajustar o pH para 8,0. Filtrar e alíquota, de acordo 50ml. Congelar a -20 ° C para armazenamento. Nota: Passo 1.2 deve ser realizada por um médico treinado profissional, como enfermeira, com um Conselho de Revisão Institucional protocolo aprovado. <ol start=…

Discussion

Para usar com sucesso o ensaio de micropipeta freqüência de adesão deve-se considerar várias etapas críticas. Primeiro, certifique-se de registrar a interação específica para o sistema de receptor-ligante de interesse. Medidas de controle não-específica (cf. fig. 3, 4) garantir a especificidade. Idealmente, as probabilidades de adesão não específica deve ser inferior a 0,05 para todas as durações de tempo de contato e ter uma diferença significativa entre as probabilidades de adesão específicas e não …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue #	Comments
10x PBS	BioWhittaker	17-517Q	Dilute to 1x with deionized water prior to use
Vacutainer EDTA	BD	366643	RBCs isolation
10ML PK100
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	RBCs isolation
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 preparation
D-glucose (dextrose)	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 preparation
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 preparation
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 preparation
Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄)	Fisher Scientific	S374	EAS-45 preparation
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 preparation
Biotin-X-NHS	Calbiochem	203188	RBCs biotinylation
Dimethylformamide (DMF)	Thermo Scientific	20673	RBCs biotinylation
Borate Buffer (0.1M)	Electron Microscopy Sciences	11455-90	RBCs biotinylation
Streptavidin	Thermo Scientific	21125	Ligand functionalizing
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Ligand functionalizing
Quantibrite PE Beads	BD Biosciences	340495	Density quantification
Flow cytometer	BD Immunocytometry Systems	BD LSR II	Density quantification
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30"	Kimble Glass Inc.	46485-1	Micropipette pulling
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP2629-1	Chamber assembly
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-G	Chamber assembly
PE α-human CD11a Clone HI 111	eBioscience	12-0119-71	Reagent for Fig.1
PE anti-human CD54	eBioscience	12-0549	Reagent for Fig.1
Mouse IgG1 Isotype Control PE	eBioscience	12-4714	Reagent for Fig.1
hydraulic micromanipulator	Narishige	MO-303	Micropipette system
Mechanical manipulator	Newport	461-xyz-m, SM-13, DM-13	Micropipette system
piezoelectric translator	Physik Instrumente	P-840	Micropipette system
LabVIEW	National Instruments	Version 8.6	Micropipette system
DAQ board	National Instruments	USB-6008	Micropipette system
Optical table	Kinetics Systems	5200 Series	Micropipette system