الخلايا Refolding الفحص
Summary
في هذا البروتوكول هو وصف طريقة لقياس البروتين داخل الخلايا refolding بعد الصدمة الحرارية. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة foldases مثل المحرمين الجزيئية وتعاونها عوامل أو مركبات قادرة على التأثير على نشاطها. يستخدم يراعة النشاط luciferase كمراسلة لقياس النشاط refolding كوصي.
Abstract
يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس النشاط الإنزيمي للمرافقين الجزيئية في نظام خلية القاعدة والآثار المحتملة للمركبات مع النشاط المثبطة / محفزة. المحرمين الجزيئية هي البروتينات المشاركة في التنظيم من البروتين للطي (1) ويكون لها دور حاسم في تعزيز بقاء الخلية على الشتائم الإجهاد مثل الصدمة الحرارية 2 والتجويع المغذيات والتعرض للمواد الكيميائية / السموم 3. لهذا السبب تم العثور على المحرمين أن تشارك في المناسبات مثل التنمية الورم ، chemioresistance الخلايا السرطانية فضلا عن 4 5 تنكس عصبي. تصميم جزيئات صغيرة قادرة على تثبيط أو تحفز نشاط هذه الانزيمات وبالتالي واحدة من أكثر الاستراتيجيات درس لعلاج السرطان والاضطرابات العصبية 7 9. في مقايسة الموصوفة هنا توفر إمكانية لقياس النشاط refolding من كوصي على وجه الخصوص والجزيئية لدراسة تأثير شركاتounds على نشاطها. في هذا الأسلوب هو transfected الجين من كوصي الجزيئية التحقيق مع تعبير لناقلات ترميز الجين luciferase يراعة. وقد وصفته بالفعل يمكن denaturated يراعة luciferase refolded بواسطة المحرمين الجزيئية 10،11. كما تطبيع السيطرة ترنسفكأيشن ، يتم ترميز transfected ناقلات للجينات في luciferase renilla. يتم تنفيذ كافة transfections الموصوفة في هذا البروتوكول مع الأبله المتطرفة جين 11 (روش) في خلايا – 293 كلوة الجنين البشري. في الخطوة الأولى ، يتم منع تصنيع البروتين عن طريق علاج الخلايا مع سيكلوهيكسيميد. بعد ذلك يتم بفعل بروتين الصدمة الحرارية التي تتكشف في 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد شفائهم عند 37 درجة مئوية ، ويتم إعادة مطوية البروتينات في التشكل بصورة نشطة ، ويستخدم نشاط luciferase يراعة للقراءة المغادرة : سوف تنتج المزيد من الضوء ، سيكون لديك المزيد من البروتين إعادة التشكل اكتسبت الأصلي. يتم تعيين غير حرارة الخلايا صدمت كمرجع (100 ٪ من refoldedluciferase).
Protocol
Discussion
في هذا العمل هو تقديم بروتوكولا لقياس نشاط الخلايا refolding من المحرمين الجزيئية. ويمكن إجراء فحص كامل في 3 إلى 4 أيام كما هو مبين من خلال نظرة عامة في الشكل. 1.
متانة والخطي من الإشارات الضوئية التي تنتجها يراعة وluciferase renilla تم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
دانيلو Maddalo هو حاصل على زمالة بحثية والفريق محقق يونغ (YIG) من معهد كارلسروه للتكنولوجيا.
Materials
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used
Programs for the Luminometer:
Renilla: Pump 1, 100 μl injection
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection
Luciferin: Pump2, 30μl injection
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:
- – 1M MgSO4 : 246,48g MgSO4*7H2O in 1 liter
- – 0,5M EGTA: 190,18g EGTA in 1 liter
- – 1M KH2PO4: 136,09g KH2PO4 in 1 liter
- – 1M K2HPO4: 228,23g K2HPO4*3H2O in 1 liter
- – 5M NaCl: 292,2g NaCl in 1 liter
- – 0,5M EDTA: 186,12g EDTA*2H2O in 1 liter
GLY-GLY-buffer:
- – 25mM Glycylglycin
- – 15mM MgSO4
- – 4mM EGTA
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.
Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:
- – 13,4mM KH2PO4
- – 86,6mM KH2PO4
- – 0,5M NaCl
- – 1mM EDTA
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.
| Company | Catalog/Product Number: | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent |
Roche | 06365809001 |
| PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X |
GIBCO | 14190-094 |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid |
SIGMA-ALDRICH | M1254 |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth |
G7278 3054.2 P027.1 |
KH2PO4 |
Roth Roth Roth Roth |
3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 |
| Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 |
References
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F. Discovery of the heat shock response. Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).
- Fuqua, S. A. Heat shock proteins and drug resistance. Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).
- Guzhova, I., Margulis, B. Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).
- Whitesell, L., Lindquist, S. L. HSP90 and the chaperoning of cancer. Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).
- Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. 17-AAG: mechanisms of antitumour activity. Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).
- Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. Targeting HSP70 for cancer therapy. Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).
- Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats. J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).
- Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).
- Thulasiraman, V., Matts, R. L. Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).
- Howarth, J. L. Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease. Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).
- Nollen, E. A. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).
