Intracellulære hvorved man genfolder Assay

Summary

I denne protokol en metode til at måle intracellulært protein, hvorved man genfolder efter heat shock er beskrevet. Denne metode kan bruges til at studere foldases som molekylær anstandsdamer og deres co-faktorer eller stoffer i stand til at påvirke deres aktivitet. Firefly luciferase aktiviteten bruges som reporter til at måle anstandsdame hvorved man genfolder aktivitet.

Abstract

Denne protokol beskriver en metode til at måle den enzymatiske aktivitet af molekylære anstandsdamer i en celle-baseret system og de mulige virkninger af stoffer med hæmmende / stimulerende aktivitet. Molekylær anstandsdamer er proteiner involveret i reguleringen af proteinfoldning ¹ og spiller en afgørende rolle i at fremme cellernes overlevelse på stress fornærmelser som heat shock ^2, næringsstof sult og eksponering for kemikalier / giftstoffer ^3. Af denne grund anstandsdamer er fundet at være involveret i begivenheder som tumor udvikling, chemioresistance af kræftceller ⁴ samt neurodegeneration ^5. Design af små molekyler i stand til at hæmme eller stimulere aktiviteten af disse enzymer er derfor en af de mest undersøgte strategier for kræftbehandling ⁷ og neurodegenerative sygdomme ^9. Analysen her beskrevne giver mulighed for at måle hvorved man genfolder aktiviteten af ​​et bestemt molekylær anstandsdame og for at undersøge effekten af ​​compounds om sine aktiviteter. I denne metode gen af ​​den molekylære undersøgte anstandsdame er transficeret sammen med en vektor kodning for ildflue luciferase genet. Det er allerede blevet beskrevet, at denatureret ildflue luciferase kan refolded ved molekylær anstandsdamer ^10,11. Som normalisering transfektion kontrol, er en vektor kodning for renilla luciferase genet transfekteret. Alle transfections beskrevet i denne protokol udføres med X-treme Gene ¹¹ (Roche) i HEK-293 celler. I det første trin, er proteinsyntesen hæmmes ved at behandle cellerne med cycloheximid. Derefter protein udfoldning er foranlediget af heat shock ved 45 ° C i 30 minutter. Ved genopretning ved 37 ° C, er proteiner igen foldet ind i deres aktive kropsbygning og aktivitet ildflue luciferase bruges som read-out: jo mere lys vil blive produceret, jo mere protein vil have igen fået de oprindelige kropsbygning. Ikke-varme chokeret celler er sat som reference (100% af refoldedluciferase).

Protocol

1. Seeding cellerne Før du starter, varme op dyrkningsmediet, PBS 1X og trypsin i et vandbad ved 37 ˚ C Tag de celler ud af kuvøsen og aspirér medium. Forsigtigt på 5 mL PBS 1X på cellerne til at vaske dem. Aspirer PBS 1X og anvende 1 mL trypsin indeholder 0,025% EDTA. Drej forsigtigt pladen for at få en jævn fordeling af trypsin. Placer celler i inkubator ved 37 ˚ C i 5-10 minutter (afhængig af celletype). Fra tid til anden kontrollere, om celler er…

Discussion

I dette arbejde en protokol til måling af intracellulære hvorved man genfolder aktivitet molekylære anstandsdamer præsenteres. Hele analysen kan udføres i 3 til 4 dage som det fremgår af oversigten i Fig. 1.

Robusthed og linearitet lyssignal produceret af ildflue og renilla luciferase repræsenterer en solid base for reproducerbarheden af ​​protokollen.

Den kritiske trin i analysen er valget af en effektiv transfektion reagens for at si…

Materials

For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used

Programs for the Luminometer:

Renilla: Pump 1, 100 μl injection

Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection

Luciferin: Pump2, 30μl injection

For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:

• –       1M MgSO₄ : 246,48g MgSO₄*7H₂O in 1 liter
• –       0,5M EGTA: 190,18g EGTA in 1 liter
• –       1M KH₂PO₄: 136,09g KH₂PO₄ in 1 liter
• –       1M K₂HPO₄: 228,23g K₂HPO₄*3H₂O in 1 liter
• –       5M NaCl: 292,2g NaCl in 1 liter
• –       0,5M EDTA: 186,12g EDTA*2H₂O in 1 liter          

GLY-GLY-buffer:

• –       25mM Glycylglycin
• –       15mM MgSO₄
• –       4mM EGTA

For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.

Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:

• –      13,4mM KH₂PO₄
• –       86,6mM KH₂PO₄
• –       0,5M NaCl
• –       1mM EDTA

For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH₂PO₄ solution, 86,6ml of a 1M K₂HPO₄ solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.

	Company	Catalog/Product Number:
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X)	GIBCO	41966029
Fetal Bovine Serum Gold	PAA	A15-151
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent	Roche	06365809001
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X	GIBCO	14190-094
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid	SIGMA-ALDRICH	M1254
Cycloheximide	SIGMA-ALDRICH	C7698
Passive Lysis Buffer 5X	Promega	E194A
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O)	SIGMA-ALDRICH Roth Roth	G7278 3054.2 P027.1
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA	Roth Roth Roth Roth	3904.1 6878.2 3957.1 8043.1
Luciferin Firefly	Biosynth	L8200
Coelenterazine	Biosynth	C7000
DTT (Dithiothreitol)	Roth	6908.2
ATP (Adenosine Triphosphate)	Roche	10519987001