I denne protokol en metode til at måle intracellulært protein, hvorved man genfolder efter heat shock er beskrevet. Denne metode kan bruges til at studere foldases som molekylær anstandsdamer og deres co-faktorer eller stoffer i stand til at påvirke deres aktivitet. Firefly luciferase aktiviteten bruges som reporter til at måle anstandsdame hvorved man genfolder aktivitet.
Denne protokol beskriver en metode til at måle den enzymatiske aktivitet af molekylære anstandsdamer i en celle-baseret system og de mulige virkninger af stoffer med hæmmende / stimulerende aktivitet. Molekylær anstandsdamer er proteiner involveret i reguleringen af proteinfoldning 1 og spiller en afgørende rolle i at fremme cellernes overlevelse på stress fornærmelser som heat shock 2, næringsstof sult og eksponering for kemikalier / giftstoffer 3. Af denne grund anstandsdamer er fundet at være involveret i begivenheder som tumor udvikling, chemioresistance af kræftceller 4 samt neurodegeneration 5. Design af små molekyler i stand til at hæmme eller stimulere aktiviteten af disse enzymer er derfor en af de mest undersøgte strategier for kræftbehandling 7 og neurodegenerative sygdomme 9. Analysen her beskrevne giver mulighed for at måle hvorved man genfolder aktiviteten af et bestemt molekylær anstandsdame og for at undersøge effekten af compounds om sine aktiviteter. I denne metode gen af den molekylære undersøgte anstandsdame er transficeret sammen med en vektor kodning for ildflue luciferase genet. Det er allerede blevet beskrevet, at denatureret ildflue luciferase kan refolded ved molekylær anstandsdamer 10,11. Som normalisering transfektion kontrol, er en vektor kodning for renilla luciferase genet transfekteret. Alle transfections beskrevet i denne protokol udføres med X-treme Gene 11 (Roche) i HEK-293 celler. I det første trin, er proteinsyntesen hæmmes ved at behandle cellerne med cycloheximid. Derefter protein udfoldning er foranlediget af heat shock ved 45 ° C i 30 minutter. Ved genopretning ved 37 ° C, er proteiner igen foldet ind i deres aktive kropsbygning og aktivitet ildflue luciferase bruges som read-out: jo mere lys vil blive produceret, jo mere protein vil have igen fået de oprindelige kropsbygning. Ikke-varme chokeret celler er sat som reference (100% af refoldedluciferase).
I dette arbejde en protokol til måling af intracellulære hvorved man genfolder aktivitet molekylære anstandsdamer præsenteres. Hele analysen kan udføres i 3 til 4 dage som det fremgår af oversigten i Fig. 1.
Robusthed og linearitet lyssignal produceret af ildflue og renilla luciferase repræsenterer en solid base for reproducerbarheden af protokollen.
Den kritiske trin i analysen er valget af en effektiv transfektion reagens for at si…
The authors have nothing to disclose.
Danilo Maddalo er en modtager af et forsknings-fællesskab, som Young Investigator Group (YIG) fra Karlsruhe Institute of Technology.
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used
Programs for the Luminometer:
Renilla: Pump 1, 100 μl injection
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection
Luciferin: Pump2, 30μl injection
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:
GLY-GLY-buffer:
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.
Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.
Company | Catalog/Product Number: | |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 |
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent |
Roche | 06365809001 |
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X |
GIBCO | 14190-094 |
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid |
SIGMA-ALDRICH | M1254 |
Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth |
G7278 3054.2 P027.1 |
KH2PO4 |
Roth Roth Roth Roth |
3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 |
Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 |
ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 |