In dit protocol een methode om intracellulair eiwit hervouwing te meten na de heat shock wordt beschreven. Deze methode kan gebruikt worden om foldases zoals moleculaire chaperonnes en hun co-factoren of verbindingen in staat om hun activiteiten van invloed te bestuderen. Vuurvlieg luciferase activiteit wordt gebruikt als reporter voor chaperonne hervouwing activiteit te meten.
Dit protocol beschrijft een methode om de enzymatische activiteit van moleculaire chaperonnes te meten in een cel-gebaseerd systeem en de mogelijke effecten van verbindingen met remmende / stimulerende activiteit. Moleculaire chaperones zijn eiwitten die betrokken zijn bij de regulatie van het vouwen van eiwitten 1 en hebben een cruciale rol bij het bevorderen van overleving van de cel op stress-beledigingen als heat shock 2, voedingsstoffen honger en blootstelling aan chemicaliën / gifstoffen 3. Om deze reden chaperones blijken te zijn betrokken bij evenementen zoals de ontwikkeling van tumoren, chemioresistance van kankercellen 4 en 5 neurodegeneratie. Ontwerp van kleine moleculen kunnen remmen of stimuleren van de activiteit van deze enzymen is dan ook een van de meest bestudeerde strategieën voor kankertherapie 7 en neurodegeneratieve aandoeningen 9. De test hier beschreven biedt de mogelijkheid om de hervouwing activiteit van een specifieke moleculaire chaperonne te meten en het effect van de comp studieounds op zijn activiteit. In deze methode het gen van de onderzochte moleculaire chaperone samen getransfecteerd met een expressievector codering voor de vuurvlieg luciferase-gen. Het is al beschreven dat gedenatureerd vuurvlieg luciferase kan worden opnieuw gevouwen door moleculaire chaperonnes 10,11. Als het normaliseren van transfectie controle is een vector die codeert voor de renilla luciferase-gen getransfecteerde. Alle transfecties beschreven in dit protocol zijn uitgevoerd met X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 cellen. In de eerste stap wordt de eiwitsynthese geremd door het behandelen van de cellen met cycloheximide. Daarna eiwitten ontvouwen wordt veroorzaakt door warmte shock bij 45 ° C gedurende 30 minuten. Na herstel bij 37 ° C, worden eiwitten opnieuw gevouwen in hun actieve conformatie en de activiteit van de vuurvlieg luciferase wordt gebruikt als read-out: hoe meer licht zal worden geproduceerd, de meer eiwitten zal opnieuw kreeg de oorspronkelijke conformatie. Niet-warmte geschokt cellen zijn ingesteld als referentie (100% van hervouwenluciferase).
In dit werk een protocol om intracellulaire hervouwing activiteit van moleculaire chaperonnes maatregel is gepresenteerd. De hele test kan worden uitgevoerd in 3 tot 4 dagen zoals blijkt uit het overzicht in Fig. 1.
De robuustheid en de lineariteit van het lichtsignaal door de vuurvlieg en de renilla luciferase vormen een solide basis voor de reproduceerbaarheid van het protocol.
De kritische stap van de test is de keuze van een efficiënte trans…
The authors have nothing to disclose.
Danilo Maddalo is een ontvanger van een onderzoeks-fellowship als Young Investigator Group (Yig) van het Karlsruhe Institute of Technology.
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used
Programs for the Luminometer:
Renilla: Pump 1, 100 μl injection
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection
Luciferin: Pump2, 30μl injection
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:
GLY-GLY-buffer:
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.
Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.
Company | Catalog/Product Number: | |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 |
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent |
Roche | 06365809001 |
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X |
GIBCO | 14190-094 |
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid |
SIGMA-ALDRICH | M1254 |
Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth |
G7278 3054.2 P027.1 |
KH2PO4 |
Roth Roth Roth Roth |
3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 |
Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 |
ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 |