Intracellulaire hervouwing Assay

Summary

In dit protocol een methode om intracellulair eiwit hervouwing te meten na de heat shock wordt beschreven. Deze methode kan gebruikt worden om foldases zoals moleculaire chaperonnes en hun co-factoren of verbindingen in staat om hun activiteiten van invloed te bestuderen. Vuurvlieg luciferase activiteit wordt gebruikt als reporter voor chaperonne hervouwing activiteit te meten.

Abstract

Dit protocol beschrijft een methode om de enzymatische activiteit van moleculaire chaperonnes te meten in een cel-gebaseerd systeem en de mogelijke effecten van verbindingen met remmende / stimulerende activiteit. Moleculaire chaperones zijn eiwitten die betrokken zijn bij de regulatie van het vouwen van eiwitten ¹ en hebben een cruciale rol bij het ​​bevorderen van overleving van de cel op stress-beledigingen als heat shock ^2, voedingsstoffen honger en blootstelling aan chemicaliën / gifstoffen ^3. Om deze reden chaperones blijken te zijn betrokken bij evenementen zoals de ontwikkeling van tumoren, chemioresistance van kankercellen ⁴ en ⁵ neurodegeneratie. Ontwerp van kleine moleculen kunnen remmen of stimuleren van de activiteit van deze enzymen is dan ook een van de meest bestudeerde strategieën voor kankertherapie ⁷ en neurodegeneratieve aandoeningen ^9. De test hier beschreven biedt de mogelijkheid om de hervouwing activiteit van een specifieke moleculaire chaperonne te meten en het effect van de comp studieounds op zijn activiteit. In deze methode het gen van de onderzochte moleculaire chaperone samen getransfecteerd met een expressievector codering voor de vuurvlieg luciferase-gen. Het is al beschreven dat gedenatureerd vuurvlieg luciferase kan worden opnieuw gevouwen door moleculaire chaperonnes ^10,11. Als het normaliseren van transfectie controle is een vector die codeert voor de renilla luciferase-gen getransfecteerde. Alle transfecties beschreven in dit protocol zijn uitgevoerd met X-treme Gene ¹¹ (Roche) in HEK-293 cellen. In de eerste stap wordt de eiwitsynthese geremd door het behandelen van de cellen met cycloheximide. Daarna eiwitten ontvouwen wordt veroorzaakt door warmte shock bij 45 ° C gedurende 30 minuten. Na herstel bij 37 ° C, worden eiwitten opnieuw gevouwen in hun actieve conformatie en de activiteit van de vuurvlieg luciferase wordt gebruikt als read-out: hoe meer licht zal worden geproduceerd, de meer eiwitten zal opnieuw kreeg de oorspronkelijke conformatie. Niet-warmte geschokt cellen zijn ingesteld als referentie (100% van hervouwenluciferase).

Protocol

1. Zaaien van de cellen Voordat u begint, warm-up de cultuur medium, de PBS 1X en de trypsine in een waterbad bij 37 ˚ C Neem de cellen uit de incubator en zuig het medium. Voorzichtig toe te passen 5 ml PBS 1X op de cellen om ze te wassen. Zuig het PBS 1X en breng 1 ml trypsine bevat 0,025% EDTA. Voorzichtig draaien de plaat een gelijkmatige verdeling van het trypsine te hebben. Plaats de cellen in de incubator bij 37 ˚ C gedurende 5-10 minuten (afhankelijk…

Discussion

In dit werk een protocol om intracellulaire hervouwing activiteit van moleculaire chaperonnes maatregel is gepresenteerd. De hele test kan worden uitgevoerd in 3 tot 4 dagen zoals blijkt uit het overzicht in Fig. 1.

De robuustheid en de lineariteit van het lichtsignaal door de vuurvlieg en de renilla luciferase vormen een solide basis voor de reproduceerbaarheid van het protocol.

De kritische stap van de test is de keuze van een efficiënte trans…

Materials

For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used

Programs for the Luminometer:

Renilla: Pump 1, 100 μl injection

Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection

Luciferin: Pump2, 30μl injection

For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:

• –       1M MgSO₄ : 246,48g MgSO₄*7H₂O in 1 liter
• –       0,5M EGTA: 190,18g EGTA in 1 liter
• –       1M KH₂PO₄: 136,09g KH₂PO₄ in 1 liter
• –       1M K₂HPO₄: 228,23g K₂HPO₄*3H₂O in 1 liter
• –       5M NaCl: 292,2g NaCl in 1 liter
• –       0,5M EDTA: 186,12g EDTA*2H₂O in 1 liter          

GLY-GLY-buffer:

• –       25mM Glycylglycin
• –       15mM MgSO₄
• –       4mM EGTA

For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.

Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:

• –      13,4mM KH₂PO₄
• –       86,6mM KH₂PO₄
• –       0,5M NaCl
• –       1mM EDTA

For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH₂PO₄ solution, 86,6ml of a 1M K₂HPO₄ solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.

	Company	Catalog/Product Number:
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X)	GIBCO	41966029
Fetal Bovine Serum Gold	PAA	A15-151
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent	Roche	06365809001
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X	GIBCO	14190-094
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid	SIGMA-ALDRICH	M1254
Cycloheximide	SIGMA-ALDRICH	C7698
Passive Lysis Buffer 5X	Promega	E194A
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O)	SIGMA-ALDRICH Roth Roth	G7278 3054.2 P027.1
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA	Roth Roth Roth Roth	3904.1 6878.2 3957.1 8043.1
Luciferin Firefly	Biosynth	L8200
Coelenterazine	Biosynth	C7000
DTT (Dithiothreitol)	Roth	6908.2
ATP (Adenosine Triphosphate)	Roche	10519987001