Intrazelluläre Rückfaltung Assay

Summary

In diesem Protokoll eine Methode, um intrazelluläre Protein Rückfaltung nach Hitzeschock Maßnahme beschrieben. Diese Methode kann verwendet werden, um foldases wie molekulare Chaperone und ihr Co-Faktoren oder Verbindungen in der Lage, ihre Tätigkeit Einfluss zu studieren. Firefly Luciferase-Aktivität wird als Reporter Chaperon Rückfaltung Aktivität zu messen.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um die enzymatische Aktivität der molekularen Chaperone in der Zelle-basierten System und die möglichen Auswirkungen von Verbindungen mit inhibitorischen / stimulierende Aktivität zu messen. Molekulare Chaperone sind Proteine, die bei der Regulation der Proteinfaltung ¹ beteiligt und spielen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der das Überleben der Zelle auf Stress Beleidigungen wie Hitzeschock ^2, Nährstoff Hunger und die Exposition gegenüber Chemikalien / Gifte ^3. Aus diesem Grund Chaperone gefunden werden, um in Veranstaltungen wie Tumor-Entwicklung, chemioresistance von Krebszellen ⁴ sowie Neurodegeneration ⁵ beteiligten werden. Design von kleinen Molekülen in der Lage zu hemmen oder stimulieren die Aktivität dieser Enzyme ist daher eine der am besten untersuchten Strategien zur Krebstherapie ⁷ und neurodegenerativen Erkrankungen ^9. Der Test hier beschrieben bietet die Möglichkeit, die Rückfaltung Aktivität eines bestimmten molekularen Chaperon zu messen und die Wirkung von comp-Studieounds über ihre Tätigkeit. Bei dieser Methode wird das Gen des molekularen Chaperon untersucht wird zusammen mit einem Expressionsvektor kodiert für die Firefly-Luciferase-Gen transfiziert. Es wurde bereits beschrieben, dass denaturierte Luciferase durch molekulare Chaperone ^10,11 kann gefaltet. Als Normalisierung Transfektion kontrollieren, ist ein Vektor-Codierung für die Renilla-Luciferase-Gen transfiziert. Alle Transfektionen in diesem Protokoll beschriebenen sind mit X-treme Gene ¹¹ (Roche) in HEK-293 Zellen durchgeführt. Im ersten Schritt wird die Proteinsynthese durch Behandlung der Zellen mit Cycloheximid gehemmt. Danach Proteinentfaltung wird durch Hitzeschock bei 45 ° C für 30 Minuten induziert. Nach Wiederaufnahme bei 37 ° C, sind Proteine ​​wieder zusammengefaltet in ihre aktive Konformation und Aktivität der Firefly-Luciferase als read-out verwendet: je mehr Licht produziert wird, desto mehr Protein wird die ursprüngliche Konformation wieder gewonnen. Non-Hitzeschock-Zellen sind als Referenz (100% des refolded gesetztLuciferase).

Protocol

1. Aussäen der Zellen Bevor Sie beginnen, wärmen das Kulturmedium, das PBS 1X und das Trypsin in einem Wasserbad bei 37 ˚ C Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen das Medium. Sanft gelten 5 ml PBS 1X auf die Zellen, um sie zu waschen. Saugen Sie das PBS 1X und gelten 1 ml Trypsin enthält 0,025% EDTA. Vorsichtig dreht die Platte um eine gleichmäßige Verteilung des Trypsin haben. Legen Sie die Zellen im Brutschrank bei 37 ˚ C für 5-10 Minuten…

Discussion

In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur intrazellulären Rückfaltung Aktivität der molekularen Chaperone Maßnahme vorgestellt. Der ganze Test kann in 3 bis 4 Tagen durchgeführt werden, wie die Übersicht in Abb. gezeigt. 1.

Die Robustheit und Linearität des Lichtsignals durch die Glühwürmchen und die Renilla-Luciferase produziert stellen eine solide Basis für die Reproduzierbarkeit des Protokolls.

Der entscheidende Schritt des Tests ist d…

Materials

For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used

Programs for the Luminometer:

Renilla: Pump 1, 100 μl injection

Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection

Luciferin: Pump2, 30μl injection

For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:

• –       1M MgSO₄ : 246,48g MgSO₄*7H₂O in 1 liter
• –       0,5M EGTA: 190,18g EGTA in 1 liter
• –       1M KH₂PO₄: 136,09g KH₂PO₄ in 1 liter
• –       1M K₂HPO₄: 228,23g K₂HPO₄*3H₂O in 1 liter
• –       5M NaCl: 292,2g NaCl in 1 liter
• –       0,5M EDTA: 186,12g EDTA*2H₂O in 1 liter          

GLY-GLY-buffer:

• –       25mM Glycylglycin
• –       15mM MgSO₄
• –       4mM EGTA

For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.

Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:

• –      13,4mM KH₂PO₄
• –       86,6mM KH₂PO₄
• –       0,5M NaCl
• –       1mM EDTA

For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH₂PO₄ solution, 86,6ml of a 1M K₂HPO₄ solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.

	Company	Catalog/Product Number:
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X)	GIBCO	41966029
Fetal Bovine Serum Gold	PAA	A15-151
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent	Roche	06365809001
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X	GIBCO	14190-094
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid	SIGMA-ALDRICH	M1254
Cycloheximide	SIGMA-ALDRICH	C7698
Passive Lysis Buffer 5X	Promega	E194A
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O)	SIGMA-ALDRICH Roth Roth	G7278 3054.2 P027.1
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA	Roth Roth Roth Roth	3904.1 6878.2 3957.1 8043.1
Luciferin Firefly	Biosynth	L8200
Coelenterazine	Biosynth	C7000
DTT (Dithiothreitol)	Roth	6908.2
ATP (Adenosine Triphosphate)	Roche	10519987001