Intracellular refolding परख

Summary

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि गर्मी झटका के बाद intracellular प्रोटीन refolding उपाय है. इस विधि आणविक संरक्षिकाओं और उनके सह कारकों या यौगिकों के लिए उनकी गतिविधि को प्रभावित करने में सक्षम की तरह foldases का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जुगनू luciferase गतिविधि निगरानी refolding गतिविधि को मापने के संवाददाता के रूप में प्रयोग किया जाता है.

Abstract

इस प्रोटोकॉल करने के लिए एक सेल आधारित एक प्रणाली और निरोधात्मक / उत्तेजक गतिविधि के साथ यौगिकों के संभावित प्रभावों में आणविक संरक्षिकाओं के enzymatic गतिविधि को मापने की विधि का वर्णन करता है. आण्विक संरक्षिकाओं ¹ तह प्रोटीन के विनियमन में शामिल प्रोटीन होते हैं और गर्मी झटका, ² पोषक तत्व भुखमरी और रसायनों / ³ विष के लिए जोखिम की तरह तनाव अपमान पर सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका है . इस कारण के लिए संरक्षिकाओं ट्यूमर के विकास, कैंसर ⁴ कोशिकाओं के chemioresistance के रूप में अच्छी तरह के रूप में ⁵ neurodegeneration तरह की घटनाओं में शामिल होना पाया जाता है. को बाधित करने के लिए या इन एंजाइमों की गतिविधि को प्रोत्साहित करने में सक्षम छोटे अणुओं ^के डिजाइन है इसलिए कैंसर ⁷ चिकित्सा और neurodegenerative विकारों 9 के लिए सबसे अधिक अध्ययन रणनीतियों में से एक है. यहाँ वर्णित परख के लिए एक विशेष आणविक निगरानी की refolding गतिविधि को मापने के लिए और COMP के प्रभाव का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता हैअपनी गतिविधि पर ounds. इस विधि में आणविक निगरानी जांच के जीन के साथ जुगनू luciferase जीन के लिए एक अभिव्यक्ति वेक्टर एन्कोडिंग के साथ ट्रांसफ़ेक्ट है. यह पहले से ही वर्णित किया गया है कि denaturated जुगनू luciferase आणविक ^10,11 संरक्षिकाओं द्वारा refolded किया जा सकता है. अभिकर्मक नियंत्रण सामान्य रूप में, renilla luciferase जीन के लिए एक वेक्टर एन्कोडिंग ट्रांसफ़ेक्ट है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी transfections X-treme ¹¹ HEK 293 कोशिकाओं में जीन (Roche) के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. पहले चरण में प्रोटीन संश्लेषण cycloheximide के साथ कोशिकाओं के इलाज से हिचकते हैं. इसके बाद खुलासा प्रोटीन गर्मी सदमे से 45 ° C पर 30 मिनट के लिए प्रेरित किया है. 37 पर वसूली करने पर डिग्री सेल्सियस, प्रोटीन फिर से जोड़ रहे हैं और उनके सक्रिय रचना में जुगनू luciferase की गतिविधि पढ़ने के बाहर के रूप में इस्तेमाल किया जाता है: और अधिक प्रकाश का उत्पादन किया जाएगा, अधिक प्रोटीन मूल रचना फिर से प्राप्त की. गैर गर्मी हैरान कक्ष संदर्भ (refolded के 100% के रूप में सेट कर रहे हैंluciferase).

Protocol

1. कोशिकाओं सीडिंग शुरू करने से पहले, 37 में मध्यम संस्कृति, Pbs 1X trypsin और गर्म पानी के स्नान में ˚ सी इनक्यूबेटर की कोशिकाओं से बाहर ले लो और मध्यम महाप्राण (व्यंजन). पीबीएस 1X के 5 एमएल धीरे उन्हें धोन?…

Discussion

इस काम में आणविक संरक्षिकाओं के intracellular refolding गतिविधि को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत है. 3 से 4 दिनों में पूरी परख प्रदर्शन किया जा सकता है जैसा कि चित्र में सिंहावलोकन द्वारा दिखाया गया ह…

Materials

For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used

Programs for the Luminometer:

Renilla: Pump 1, 100 μl injection

Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection

Luciferin: Pump2, 30μl injection

For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:

• –       1M MgSO₄ : 246,48g MgSO₄*7H₂O in 1 liter
• –       0,5M EGTA: 190,18g EGTA in 1 liter
• –       1M KH₂PO₄: 136,09g KH₂PO₄ in 1 liter
• –       1M K₂HPO₄: 228,23g K₂HPO₄*3H₂O in 1 liter
• –       5M NaCl: 292,2g NaCl in 1 liter
• –       0,5M EDTA: 186,12g EDTA*2H₂O in 1 liter          

GLY-GLY-buffer:

• –       25mM Glycylglycin
• –       15mM MgSO₄
• –       4mM EGTA

For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.

Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:

• –      13,4mM KH₂PO₄
• –       86,6mM KH₂PO₄
• –       0,5M NaCl
• –       1mM EDTA

For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH₂PO₄ solution, 86,6ml of a 1M K₂HPO₄ solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.

	Company	Catalog/Product Number:
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X)	GIBCO	41966029
Fetal Bovine Serum Gold	PAA	A15-151
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent	Roche	06365809001
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X	GIBCO	14190-094
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid	SIGMA-ALDRICH	M1254
Cycloheximide	SIGMA-ALDRICH	C7698
Passive Lysis Buffer 5X	Promega	E194A
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O)	SIGMA-ALDRICH Roth Roth	G7278 3054.2 P027.1
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA	Roth Roth Roth Roth	3904.1 6878.2 3957.1 8043.1
Luciferin Firefly	Biosynth	L8200
Coelenterazine	Biosynth	C7000
DTT (Dithiothreitol)	Roth	6908.2
ATP (Adenosine Triphosphate)	Roche	10519987001