In questo protocollo un metodo per misurare ripiegamento delle proteine intracellulari dopo shock termico è descritto. Questo metodo può essere utilizzato per studiare foldases come chaperon molecolari e la loro co-fattori o composti in grado di influenzare la loro attività. Attività Firefly luciferasi viene utilizzato come reporter per misurare l'attività ripiegamento accompagnatore.
Questo protocollo descrive un metodo per misurare l'attività enzimatica di chaperon molecolare in una cella e sistemi basati su possibili effetti di composti con attività inibitoria / stimolante. Chaperon molecolari sono proteine coinvolte nella regolazione di protein folding 1 e hanno un ruolo cruciale nel promuovere la sopravvivenza delle cellule su insulti dello stress come heat shock 2, la fame di nutrienti e l'esposizione a sostanze chimiche / veleni 3. Per questo motivo accompagnatori si trovano ad essere coinvolti in eventi come lo sviluppo del tumore, chemioresistance delle cellule tumorali 4, nonché neurodegenerazione 5. Progettazione di piccole molecole in grado di inibire o stimolare l'attività di questi enzimi è quindi una delle strategie più studiate per la terapia del cancro 7 e malattie neurodegenerative 9. Il test qui descritto offre la possibilità di misurare l'attività ripiegamento di un chaperone molecolare particolare e per studiare l'effetto di compounds sulla sua attività. In questo metodo il gene del chaperone molecolare indagato è transfettate con una codifica espressione vettore per il gene della luciferasi lucciola. E 'stato già descritto che denaturato luciferasi lucciola può essere ripiegata da chaperon molecolare 10,11. Come normalizzare il controllo transfezione, un vettore di codifica per il gene della luciferasi è Renilla transfettate. Tutti trasfezioni descritto in questo protocollo vengono eseguiti con X-treme Gene 11 (Roche) in cellule HEK-293. Nella prima fase, la sintesi proteica è inibita trattando le cellule con cicloesimide. Successivamente le proteine svolgimento è indotto da shock termico a 45 ° C per 30 minuti. Dopo il recupero a 37 ° C, le proteine sono ri-piegati nella loro conformazione attiva e l'attività della luciferasi lucciola è usato come read-out: la luce più sarà prodotto, la proteina più avrà riguadagnato la conformazione originale. Cellule scioccato non-calore sono impostati come riferimento (100% del ripiegatoluciferasi).
In questo lavoro un protocollo per misurare l'attività intracellulare ripiegamento di chaperon molecolare è presentato. Il dosaggio intero può essere eseguita in 3 o 4 giorni come mostrato dalla visione d'insieme in fig. 1.
La robustezza e la linearità del segnale luminoso prodotto dalla lucciola e la luciferasi Renilla rappresentano una solida base per la riproducibilità del protocollo.
La fase critica del saggio è la scelta di un …
The authors have nothing to disclose.
Danilo Maddalo è un destinatario di una borsa di ricerca come Gruppo Young Investigator (YIG) presso l'Istituto di tecnologia di Karlsruhe.
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used
Programs for the Luminometer:
Renilla: Pump 1, 100 μl injection
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection
Luciferin: Pump2, 30μl injection
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:
GLY-GLY-buffer:
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.
Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.
Company | Catalog/Product Number: | |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 |
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent |
Roche | 06365809001 |
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X |
GIBCO | 14190-094 |
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid |
SIGMA-ALDRICH | M1254 |
Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth |
G7278 3054.2 P027.1 |
KH2PO4 |
Roth Roth Roth Roth |
3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 |
Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 |
ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 |