細胞内のリフォールディングアッセイ
Summary
このプロトコルでは熱ショック後に細胞内タンパク質のリフォールディングを測定する方法が記載されている。このメソッドは、その活性に影響を与えることができる分子シャペロンとその補因子または化合物のようなfoldasesを研究するために使用することができます。ホタルルシフェラーゼ活性は、シャペロンのリフォールディング活性を測定するためのレポーターとして使用されます。
Abstract
このプロトコルは、セルベースのシステムと抑制性/刺激活性を持つ化合物の可能性のある影響で、分子シャペロンの酵素活性を測定する方法を説明します。分子シャペロンは、1を折るタンパク質の調節に関与するタンパク質であり、熱ショック2のようなストレスの侮辱、栄養飢餓および化学薬品/毒3に曝すと細胞の生存を促進する上で重要な役割を持っている。このような理由からシャペロンは、腫瘍の開発、がん細胞4のchemioresistanceだけでなく、神経変性5のようなイベントに関与していることが発見されています。これらの酵素の活性を阻害または刺激することができる小分子の設計は、したがって、癌治療7と神経変性疾患9のほとんどの研究戦略の1つです。ここに記載のアッセイは、特定の分子シャペロンのリフォールディング活性を測定すると、コンピュータの効果を研究する可能性を提供その活動上ounds。この方法で調査、分子シャペロンの遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターのエンコーディングと一緒にトランスフェクトされる。それはすでに変性ホタルルシフェラーゼが分子シャペロン10,11によってリフォールディングすることができることが記載されている。トランスフェクションのコントロールを正常化するとして、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子のコードするベクターをトランスフェクトされる。このプロトコルで説明されているすべてのトランスフェクションは、HEK – 293細胞におけるX -番手ジーン11（ロシュ）で実行されます。最初のステップでは、タンパク質合成は、シクロヘキシミドで細胞を処理することにより阻害される。その後、アンフォールディングタンパク質は、30分間45℃での熱ショックによって誘導される。 37回復° C時には、タンパク質はその活性コンフォメーションに再折り畳まれているとホタルルシフェラーゼの活性は、読み出しとして使用される：より多くの光が生成される、より多くの蛋白質は元のコンフォメーションを再度得ているだろう。非熱ショック細胞は、参照（リフォールディングの100％として設定されていますルシフェラーゼ）。
Protocol
Discussion
本研究では分子シャペロンの細胞内のリフォールディング活性を測定するためのプロトコルが表示されます。 図の概要が示すように全体のアッセイは、3〜4日で行うことができます。 1。
ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼによって生成される光信号の堅牢性と直線性は、プロトコルの再現性のための強固な基盤を表しています。
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ダニーロMaddaloは、カールスルーエ工科大学から若手研究者グループ（YIG）などの研究フェローシップの受賞者です。
Materials
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used
Programs for the Luminometer:
Renilla: Pump 1, 100 μl injection
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection
Luciferin: Pump2, 30μl injection
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:
- – 1M MgSO4 : 246,48g MgSO4*7H2O in 1 liter
- – 0,5M EGTA: 190,18g EGTA in 1 liter
- – 1M KH2PO4: 136,09g KH2PO4 in 1 liter
- – 1M K2HPO4: 228,23g K2HPO4*3H2O in 1 liter
- – 5M NaCl: 292,2g NaCl in 1 liter
- – 0,5M EDTA: 186,12g EDTA*2H2O in 1 liter
GLY-GLY-buffer:
- – 25mM Glycylglycin
- – 15mM MgSO4
- – 4mM EGTA
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.
Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:
- – 13,4mM KH2PO4
- – 86,6mM KH2PO4
- – 0,5M NaCl
- – 1mM EDTA
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.
| Company | Catalog/Product Number: | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent |
Roche | 06365809001 |
| PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X |
GIBCO | 14190-094 |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid |
SIGMA-ALDRICH | M1254 |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth |
G7278 3054.2 P027.1 |
KH2PO4 |
Roth Roth Roth Roth |
3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 |
| Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 |
References
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