I denne protokollen en metode for å måle intracellulært protein refolding etter varmesjokkproteiner er beskrevet. Denne metoden kan brukes til å studere foldases som molekylær anstand og deres co-faktorer eller forbindelser i stand til å påvirke deres aktivitet. Firefly luciferase aktivitet brukes som reporter for å måle anstand refolding aktivitet.
Denne protokollen beskriver en metode for å måle enzymatisk aktivitet av molekylære anstand i en celle-basert system, og mulige effekter av forbindelser med hemmende / stimulerende aktivitet. Molecular anstand er proteiner involvert i regulering av protein folding 1 og har en avgjørende rolle i å fremme celle overlevelse ved stresset fornærmelser som heat shock 2, nærings sult og eksponering for kjemikalier / giftstoffer 3. Av denne grunn anstand er funnet å være involvert i hendelser som tumor utvikling, chemioresistance av kreft celler 4 samt neurodegeneration 5. Design av små molekyler i stand til å hemme eller stimulere aktiviteten av disse enzymene er derfor en av de mest studerte strategier for kreftbehandling 7 og nevrodegenerative lidelser 9. Analysen her er beskrevet gir muligheten til å måle refolding aktiviteten til et bestemt molekylær anstand og å studere effekten av compounds på sin virksomhet. I denne metoden genet av molekylære anstand undersøkt er transfektert sammen med et uttrykk vektor koding for ildfluen luciferase genet. Det er allerede beskrevet som denaturated ildflue luciferase kan refolded av molekylær anstand 10,11. Som normalisering transfeksjon kontroll, er en vektor koding for renilla luciferase genet transfektert. Alle transfections beskrevet i denne protokollen er utført med X-treme Gene 11 (Roche) i HEK-293 celler. I det første trinnet, er proteinsyntesen hemmes ved å behandle cellene med cycloheximide. Deretter protein unfolding er indusert av varme sjokk ved 45 ° C i 30 minutter. Ved utvinning ved 37 ° C, er proteiner re-brettet i sine aktive konformasjon og aktiviteten av ildfluen luciferase brukes som read-out: jo mer lys vil bli produsert, jo mer protein vil ha re-fått den opprinnelige eksteriør. Non-varme sjokkert celler er satt som referanse (100% av refoldedluciferase).
I dette arbeidet en protokoll for å måle intracellulære refolding aktivitet av molekylære anstand presenteres. Hele analysen kan utføres i 3 til 4 dager slik det fremkommer av oversikten i fig. 1.
Robusthet og linearitet av lyset signal produsert av ildflue og renilla luciferase representerer en solid base for reproduserbarheten av protokollen.
Den kritiske trinn i analysen er valget av en effektiv transfeksjon reagens å sikre overekspresjo…
The authors have nothing to disclose.
Danilo Maddalo er en mottaker av en stipendiatstilling som Young Investigator Group (YIG) fra Karlsruhe Institute of Technology.
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used
Programs for the Luminometer:
Renilla: Pump 1, 100 μl injection
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection
Luciferin: Pump2, 30μl injection
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:
GLY-GLY-buffer:
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.
Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.
Company | Catalog/Product Number: | |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 |
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent |
Roche | 06365809001 |
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X |
GIBCO | 14190-094 |
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid |
SIGMA-ALDRICH | M1254 |
Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth |
G7278 3054.2 P027.1 |
KH2PO4 |
Roth Roth Roth Roth |
3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 |
Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 |
ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 |