Intracellulære Refolding Assay

Summary

I denne protokollen en metode for å måle intracellulært protein refolding etter varmesjokkproteiner er beskrevet. Denne metoden kan brukes til å studere foldases som molekylær anstand og deres co-faktorer eller forbindelser i stand til å påvirke deres aktivitet. Firefly luciferase aktivitet brukes som reporter for å måle anstand refolding aktivitet.

Abstract

Denne protokollen beskriver en metode for å måle enzymatisk aktivitet av molekylære anstand i en celle-basert system, og mulige effekter av forbindelser med hemmende / stimulerende aktivitet. Molecular anstand er proteiner involvert i regulering av protein folding ¹ og har en avgjørende rolle i å fremme celle overlevelse ved stresset fornærmelser som heat shock ^2, nærings sult og eksponering for kjemikalier / giftstoffer ^3. Av denne grunn anstand er funnet å være involvert i hendelser som tumor utvikling, chemioresistance av kreft celler ^{4 samt} neurodegeneration ^5. Design av små molekyler i stand til å hemme eller stimulere aktiviteten av disse enzymene er derfor en av de mest studerte strategier for kreftbehandling ⁷ og nevrodegenerative lidelser ^9. Analysen her er beskrevet gir muligheten til å måle refolding aktiviteten til et bestemt molekylær anstand og å studere effekten av compounds på sin virksomhet. I denne metoden genet av molekylære anstand undersøkt er transfektert sammen med et uttrykk vektor koding for ildfluen luciferase genet. Det er allerede beskrevet som denaturated ildflue luciferase kan refolded av molekylær anstand ^10,11. Som normalisering transfeksjon kontroll, er en vektor koding for renilla luciferase genet transfektert. Alle transfections beskrevet i denne protokollen er utført med X-treme Gene ¹¹ (Roche) i HEK-293 celler. I det første trinnet, er proteinsyntesen hemmes ved å behandle cellene med cycloheximide. Deretter protein unfolding er indusert av varme sjokk ved 45 ° C i 30 minutter. Ved utvinning ved 37 ° C, er proteiner re-brettet i sine aktive konformasjon og aktiviteten av ildfluen luciferase brukes som read-out: jo mer lys vil bli produsert, jo mer protein vil ha re-fått den opprinnelige eksteriør. Non-varme sjokkert celler er satt som referanse (100% av refoldedluciferase).

Protocol

1. Seeding cellene Før du begynner, varm opp kulturen medium, PBS 1X og trypsin i et vannbad ved 37 ˚ C Ta cellene ut av inkubatoren og aspirer mediet. Forsiktig gjelder 5 ml PBS 1X på cellene for å vaske dem. Aspirer PBS 1X og gjelder 1 mL trypsin inneholder 0025% EDTA. Forsiktig rotere plate til å ha en jevn fordeling av trypsin. Plasser cellene i inkubator ved 37 ˚ C i 5-10 minutter (avhengig av celletype). Fra tid til annen se om cellene er frittligg…

Discussion

I dette arbeidet en protokoll for å måle intracellulære refolding aktivitet av molekylære anstand presenteres. Hele analysen kan utføres i 3 til 4 dager slik det fremkommer av oversikten i fig. 1.

Robusthet og linearitet av lyset signal produsert av ildflue og renilla luciferase representerer en solid base for reproduserbarheten av protokollen.

Den kritiske trinn i analysen er valget av en effektiv transfeksjon reagens å sikre overekspresjo…

Materials

For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used

Programs for the Luminometer:

Renilla: Pump 1, 100 μl injection

Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection

Luciferin: Pump2, 30μl injection

For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:

• –       1M MgSO₄ : 246,48g MgSO₄*7H₂O in 1 liter
• –       0,5M EGTA: 190,18g EGTA in 1 liter
• –       1M KH₂PO₄: 136,09g KH₂PO₄ in 1 liter
• –       1M K₂HPO₄: 228,23g K₂HPO₄*3H₂O in 1 liter
• –       5M NaCl: 292,2g NaCl in 1 liter
• –       0,5M EDTA: 186,12g EDTA*2H₂O in 1 liter          

GLY-GLY-buffer:

• –       25mM Glycylglycin
• –       15mM MgSO₄
• –       4mM EGTA

For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.

Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:

• –      13,4mM KH₂PO₄
• –       86,6mM KH₂PO₄
• –       0,5M NaCl
• –       1mM EDTA

For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH₂PO₄ solution, 86,6ml of a 1M K₂HPO₄ solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.

	Company	Catalog/Product Number:
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X)	GIBCO	41966029
Fetal Bovine Serum Gold	PAA	A15-151
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent	Roche	06365809001
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X	GIBCO	14190-094
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid	SIGMA-ALDRICH	M1254
Cycloheximide	SIGMA-ALDRICH	C7698
Passive Lysis Buffer 5X	Promega	E194A
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O)	SIGMA-ALDRICH Roth Roth	G7278 3054.2 P027.1
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA	Roth Roth Roth Roth	3904.1 6878.2 3957.1 8043.1
Luciferin Firefly	Biosynth	L8200
Coelenterazine	Biosynth	C7000
DTT (Dithiothreitol)	Roth	6908.2
ATP (Adenosine Triphosphate)	Roche	10519987001