I detta protokoll en metod för att mäta intracellulära proteinet vika efter heat shock beskrivs. Denna metod kan användas för att studera foldases som molekylära följeslagare och deras co-faktorer eller föreningar möjlighet att påverka deras verksamhet. Firefly luciferas aktivitet används som reporter för att mäta aktiviteten förkläde vika.
Detta protokoll beskriver en metod för att mäta den enzymatiska aktiviteten hos molekylära följeslagare i en cell-baserat system och eventuella effekter av substanser med hämmande / stimulerande aktivitet. Molekylär följeslagare är proteiner involverade i regleringen av protein folding 1 och har en avgörande roll för att främja cellöverlevnad på stressen förolämpningar som heat shock 2, näringsämnen svält och exponering för kemikalier / gifter 3. Av denna anledning följeslagare befinns vara inblandade i händelser som tumörutveckling, chemioresistance av cancerceller 4 samt neurodegeneration 5. Design av små molekyler kan hämma eller stimulera aktiviteten hos dessa enzymer är därför en av de mest studerade strategierna för cancerbehandling 7 och neurodegenerativa sjukdomar 9. Analysen beskrivs här ger möjlighet att mäta vika aktiviteten av en viss molekylär förkläde och att studera effekten av Compounds om sin verksamhet. I denna metod genen av de undersökta molekylära förkläde är transfekterade tillsammans med ett uttryck vektor kodning för eldfluga luciferas genen. Det har redan beskrivits som denaturerad eldfluga luciferas kan refolded av molekylära följeslagare 10,11. Som normalisera transfektion kontroll, är en vektor kodning för renilla luciferas genen transfekterades. Alla transfections som beskrivs i detta protokoll utförs med X-treme Gene 11 (Roche) i HEK-293 celler. I det första steget är proteinsyntesen hämmas genom att behandla cellerna med cykloheximid. Därefter proteinet utspelas induceras av värme chock vid 45 ° C i 30 minuter. När återhämtningen vid 37 ° C, är proteiner åter viks i deras aktiva konformation och aktivitet för Firefly luciferas används som läste ut: desto mer ljus kommer att produceras, desto mer protein har åter fått den ursprungliga exteriör. Icke-värme chockad cellerna in som referens (100% av refoldedluciferas).
I detta arbete ett protokoll för att mäta intracellulära vika aktivitet molekylär följeslagare presenteras. Hela analysen kan utföras på 3 till 4 dagar vilket framgår av översikten i figur. 1.
Robusthet och linjäritet ljussignal produceras av eldfluga och renilla luciferas utgör en solid grund för reproducerbarhet i protokollet.
Den kritiska steg i analysen är valet av en effektiv transfektion reagens för att säkerställa att över…
The authors have nothing to disclose.
Danilo Maddalo är mottagare av en forskartjänst som Young Investigator Group (YIG) från Karlsruhe Institute of Technology.
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used
Programs for the Luminometer:
Renilla: Pump 1, 100 μl injection
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection
Luciferin: Pump2, 30μl injection
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:
GLY-GLY-buffer:
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.
Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.
Company | Catalog/Product Number: | |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 |
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent |
Roche | 06365809001 |
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X |
GIBCO | 14190-094 |
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid |
SIGMA-ALDRICH | M1254 |
Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth |
G7278 3054.2 P027.1 |
KH2PO4 |
Roth Roth Roth Roth |
3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 |
Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 |
ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 |