Intracellulär vika analys

Summary

I detta protokoll en metod för att mäta intracellulära proteinet vika efter heat shock beskrivs. Denna metod kan användas för att studera foldases som molekylära följeslagare och deras co-faktorer eller föreningar möjlighet att påverka deras verksamhet. Firefly luciferas aktivitet används som reporter för att mäta aktiviteten förkläde vika.

Abstract

Detta protokoll beskriver en metod för att mäta den enzymatiska aktiviteten hos molekylära följeslagare i en cell-baserat system och eventuella effekter av substanser med hämmande / stimulerande aktivitet. Molekylär följeslagare är proteiner involverade i regleringen av protein folding ¹ och har en avgörande roll för att främja cellöverlevnad på stressen förolämpningar som heat shock ^2, näringsämnen svält och exponering för kemikalier / gifter ^3. Av denna anledning följeslagare befinns vara inblandade i händelser som tumörutveckling, chemioresistance av cancerceller ⁴ samt neurodegeneration ^5. Design av små molekyler kan hämma eller stimulera aktiviteten hos dessa enzymer är därför en av de mest studerade strategierna för cancerbehandling ⁷ och neurodegenerativa sjukdomar ^9. Analysen beskrivs här ger möjlighet att mäta vika aktiviteten av en viss molekylär förkläde och att studera effekten av Compounds om sin verksamhet. I denna metod genen av de undersökta molekylära förkläde är transfekterade tillsammans med ett uttryck vektor kodning för eldfluga luciferas genen. Det har redan beskrivits som denaturerad eldfluga luciferas kan refolded av molekylära följeslagare ^10,11. Som normalisera transfektion kontroll, är en vektor kodning för renilla luciferas genen transfekterades. Alla transfections som beskrivs i detta protokoll utförs med X-treme Gene ¹¹ (Roche) i HEK-293 celler. I det första steget är proteinsyntesen hämmas genom att behandla cellerna med cykloheximid. Därefter proteinet utspelas induceras av värme chock vid 45 ° C i 30 minuter. När återhämtningen vid 37 ° C, är proteiner åter viks i deras aktiva konformation och aktivitet för Firefly luciferas används som läste ut: desto mer ljus kommer att produceras, desto mer protein har åter fått den ursprungliga exteriör. Icke-värme chockad cellerna in som referens (100% av refoldedluciferas).

Protocol

1. Sådd cellerna Före start, värma upp odlingsmedium PBS 1X och trypsin i ett vattenbad vid 37 ˚ C Ta cellerna ur kuvösen och aspirera mediet. Applicera försiktigt 5 mL PBS 1X på cellerna för att tvätta dem. Aspirera PBS 1X och applicera 1 ml trypsin innehåller 0,025% EDTA. Snurra plattan att ha en jämn fördelning av trypsin. Placera cellerna i inkubator vid 37 ˚ C i 5-10 minuter (beroende på celltyp). Från tid till annan kolla om cellerna loss …

Discussion

I detta arbete ett protokoll för att mäta intracellulära vika aktivitet molekylär följeslagare presenteras. Hela analysen kan utföras på 3 till 4 dagar vilket framgår av översikten i figur. 1.

Robusthet och linjäritet ljussignal produceras av eldfluga och renilla luciferas utgör en solid grund för reproducerbarhet i protokollet.

Den kritiska steg i analysen är valet av en effektiv transfektion reagens för att säkerställa att över…

Materials

For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used

Programs for the Luminometer:

Renilla: Pump 1, 100 μl injection

Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection

Luciferin: Pump2, 30μl injection

For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:

• –       1M MgSO₄ : 246,48g MgSO₄*7H₂O in 1 liter
• –       0,5M EGTA: 190,18g EGTA in 1 liter
• –       1M KH₂PO₄: 136,09g KH₂PO₄ in 1 liter
• –       1M K₂HPO₄: 228,23g K₂HPO₄*3H₂O in 1 liter
• –       5M NaCl: 292,2g NaCl in 1 liter
• –       0,5M EDTA: 186,12g EDTA*2H₂O in 1 liter          

GLY-GLY-buffer:

• –       25mM Glycylglycin
• –       15mM MgSO₄
• –       4mM EGTA

For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.

Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:

• –      13,4mM KH₂PO₄
• –       86,6mM KH₂PO₄
• –       0,5M NaCl
• –       1mM EDTA

For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH₂PO₄ solution, 86,6ml of a 1M K₂HPO₄ solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.

	Company	Catalog/Product Number:
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X)	GIBCO	41966029
Fetal Bovine Serum Gold	PAA	A15-151
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent	Roche	06365809001
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X	GIBCO	14190-094
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid	SIGMA-ALDRICH	M1254
Cycloheximide	SIGMA-ALDRICH	C7698
Passive Lysis Buffer 5X	Promega	E194A
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O)	SIGMA-ALDRICH Roth Roth	G7278 3054.2 P027.1
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA	Roth Roth Roth Roth	3904.1 6878.2 3957.1 8043.1
Luciferin Firefly	Biosynth	L8200
Coelenterazine	Biosynth	C7000
DTT (Dithiothreitol)	Roth	6908.2
ATP (Adenosine Triphosphate)	Roche	10519987001