培養交感神経ニューロンの樹状成長を誘導する

Summary

我々は選択的に周産期ラットの上頚神経節（SCG）から解離し、主交感神経ニューロンの樹状突起の成長を誘導する骨形成タンパク質-7（BMP-7）またはマトリゲルを使用するためのプロトコルについて説明します。

Abstract

樹アーバの形状は、ニューロン^1-3受信し、これらの入力^4-6の種類と分布に影響を与えることができ、合計シナプス入力を決定します。樹枝状成長と可塑性の変化のパターンは実験モデル⁷の障害神経行動機能に関連付けられていると、発達障害^8-10と^11-13の神経変性疾患の両方で観察された臨床症状に寄与すると考えられる。このような観測が正確に樹枝状形態を調節する機能の重要性を強調し、樹枝状成長を制御するメカニズムを識別する唯一の正常な発達の間に規制されてどのように神経接続の理解を進めるませんが、また、多様な神経疾患の新規治療戦略についての洞察を提供することを示唆している。

樹枝状成長機構の研究が大幅に可用性oによって促進されるであろうニューロンは実験的に、彼らは彼らのin vivoでの対応と同等の樹アーバを策定したものに樹状突起を拡張することはありませんている状態から切り替えることができるようになり、FAモデルのシステム。周産期のげっ歯類の上頚神経節（SCG）から解離交感神経ニューロンの初代培養は、このようなモデルを提供します。血清および神経節グリア細胞の不在下で定義された培地で培養したときに、交感神経ニューロンは軸索である単一のプロセスを拡張し、このユニポーラ状態は、培養^14,15で数週間から数カ月持続します。しかし、培地への骨形成タンパク質-7のいずれかの追加^{（BMP-7）16,17}またはマトリゲル^18は樹状突起のために、形態学的生化学的および機能的な基準を満たす複数のプロセスを拡張するために、これらのニューロンをトリガーします。周産期のげっ歯類のSCGから解離し、定義された条件下で増殖交感神経ニューロンは、ニューロン¹⁹の均一な集団であるマトリゲル、BMP-7とデカペンタプレジック（DPP）と60A亜^17,18,20,21の他のBMPの樹状突起促進活性に均一に対応すること。重要なのは、マトリゲルとBMPによって誘導される樹状突起の形成は、細胞の生存や軸索の成長^17,18の変化の有無で発生します。

ここで、我々は、彼らがマトリゲルまたはBMPの選択的な樹状突起促進活性に応答するように周産期ラットのSCGから派生した交感神経の神経細胞の解離文化をセットアップする方法について説明します。

Protocol

1。培地の調製（C2培地） 記載されている順序で、滅菌、使い捨ての500ミリリットルの三角フラスコに、次の行を追加します。 量 コンポーネント 最終濃度 190ミリリットル DMEM（低グルコース） N / A 10ミリリットル脂肪酸フリーBSA（DMEMで20mg/ml） 50μg/…

Discussion

このモデルの利点は、（a）文化が他の細胞型^17,23を欠いている交感神経の神経細胞の均一な集団で構成されていること、（b）交感神経ニューロンの成長因子の要件が十分に確立されている、の使用を許可する定義されているメディア、および定義された様々なメディア、および基板^23を成長させ、交感神経ニューロンを維持するためにうまく機能し、（c）これらの培養物に?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Glass coverslips	Bellco	1943-10012	12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets	Bellco	1273-50003
Poly-D-lysine	Sigma	P0899-100MG	Stock solution 1 mg/ml
Distilled water	Gibco	15230
Fine forceps Dumont no. 4 and 5	Fine Science Tools (FST)	11252-30 11241-30
20-gauge needles	Becton Dickinson	305176
Leibovitz’s L-15 medium	Invitrogen	11415
Collagenase	Worthington	4176	1 mg/ml
Dispase	Roche	04942078001	5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg)	Invitrogen	14185-052
DMEM Low glucose	Invitrogen	11885
L-Glutamine	Invitrogen	25030	20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium	Invitrogen	51500-056	100X
Fatty-acid free BSA	Calbiochem	126609
NGF	Harlan Bioproducts	5017
Ham F-12 nutrient medium (F-12)	Invitrogen	11765
Cytosine arabinoside	Sigma	C1768
Matrigel	BD Biosciences	356234	Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7	R&D Systems Curis, Inc.	345-BP BMP7-07H	BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Mouse anti-rat MAP2 antibody	Sternberg Monoclonals Inc.	SMI52	1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse	Invitrogen	A11003	1/10000
Mounting media	Prolong Antifade kit Molecular Probes	P7481

Table 1. Materials.