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Bioingegneria

고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착

Published: December 02, 2011
doi:
10.3791/3560
,
1Department of Physics,Syracuse University

Summary

무기 표면에 단백질이 아닌 구체적인 흡착을 모니터링하는 고체 nanopores를 사용하는 방법을 설명합니다. 방법은 실시간과 단일 분자 수준에서 탐색할 수 흡착 수있게 저항 펄스의 원칙을 사용합니다. 하나의 단백질 흡착 과정 멀리 평형에서이기 때문에, 우리는 양적 단백질 흡착의 상수 명백한 처음 주문 반응 속도의 결정뿐만 아니라 및 Langmuir 흡착 상수 사용, 합성 nanopores의 병렬 배열의 고용을 제안합니다.

Abstract

고체 nanopores은 지역 구조와 유연성 핵산 1-6, 단백질 7 전개, 그리고 다른 리간드 8 바인딩 선호도를 조사하는 단일 분자 수준에서 측정을 수행하는 데 사용되었습니다. 9-12 저항 펄스 기술로 이러한 nanopores을 결합함으로써, 그러한 측정은 다양한 조건 하에서와 라벨 3에 대한 필요없이 할 수 있습니다. 저항 펄스 기술에서는 이온 소금 솔루션은 nanopore의 양쪽에 도입입니다. 따라서, 이온은 지속적으로 현재의 결과, 적용 transmembrane 잠재력에 의해 챔버의 한쪽에서 다른 구동됩니다. nanopore에 analyte의 파티션은 단일 분자 정보를 추출하는 분석할 수이 현재에 잘 정의된 편향을 발생합니다. 이 기법을 사용하여 nanopore 벽에 단일 단백질의 흡착은 다양한 범위의 아래에 모니터할 수 있습니다조건 13. microfluidic 장치의 크기 축소로, 하나의 단백질과 함께 이러한 시스템의 상호 작용이 우려되고 있기 때문에 단백질 흡착은 중요성이 높아지고있다. 이 프로토콜은 쉽게 nanopore 드릴링 의무가 다른 박막, 또는 작용 질화 표면에 확장될 수 있습니다 질화물 필름에 바인딩 단백질에 대한 신속한 분석을 설명합니다. 단백질의 다양한 솔루션 및 denaturing 조건 하에서 광범위한 탐험 수 있습니다. 또한이 프로토콜은 nanopore 분광법을 사용하여보다 기본적인 문제를 탐구하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. 실리콘 질화물 점막에서 고체 nanopores의 제조 200 kV의 가속 전압에 황비홍 Tecnai F20 S / TEM을 가져와. 다른 S / TEM을 사용하는 경우, 가속 전압보다 크거나 200 kV 9이어야합니다 TEM 샘플 홀더에 20 nm의 두꺼운 SPI 실리콘 질화물 창 그리드를로드하고 소유자로부터 오염 물질을 제거하는 30 초 동안 산소 플라즈마로 닦아주십시오. S / TEM에 샘플을로드하고 아래 펌프로 진?…

Discussion

고체 표면에 27-29로 단백질의 자연 흡착는 biochip 응용 프로그램 및 기능 하이브리드의 biomaterials의 새로운 클래스의 디자인 분야의 숫자에 근본적으로 중요합니다. 이전 연구는 고체 표면에 adsorbed 단백질이 측면이나 이동성을 크게 탈착 속도를 표시하지 않는 것으로 나타났습니다, 따라서 단백질 흡착은 일반적으로 돌이킬 수와 특이 현상이 프로세스를 30-32로 간주됩니다. 고체 ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자들은 조언 존 Grazul (코넬 대학), 안드레 Marziali (밴쿠버에서 브리티시 컬럼비아 대학)와 빈센트 토바드 – Cossa을 (오타와 대학) 감사드립니다. 이 작품은 미국 국립 과학 재단 (DMR – 0706517와 DMR – 1006332)와 국립 보건원 (R01 – GM088403)에서 부여로 일부 자금이다. 재료 연구 과학 및 공학 센터 (MRSEC) 프로그램 (DMR 0520404) – nanopore 드릴링은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 지원으로 재료 연구 코넬 센터 (CCMR)의 전자 현미경 시설에서 수행되었다. 실리콘 질화물 점막의 준비는 국립 과학 재단 (부여 항법 – 0335765)에서 지원하는 코넬 NanoScale 시설, 국립 나노기술 인프라 네트워크의 일원에서 실시되었습니다.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Tecnai F20 S/TEM FEI   S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source.
20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM SPI 4163SN-BA  
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices    
Axon Digidata 1440A Molecular Devices    
pCLAMP 10 software Molecular Devices   Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software
Sulfuric Acid Fisher Scientific A300  
hydrogen peroxide Fisher Scientific H325  
silicone O-rings McMaster-Carr 003 S70 Alternatively use PDMS
silver wire Sigma-Aldrich 348759 For electrodes
SPC Technology, D sub contact, pin Newark 9K4978 For electrodes
potassium chloride Sigma P9541  
potassium phosphate dibasic Sigma P2222  
potassium phosphate monobasic Sigma P5379  
PDMS Dow Corning   Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber.
Kwik-Cast Sealant World Precision Instruments KWIK-CAST Fast acting silicone sealant
hot plate Fisher Scientific    
Faraday cage      
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Solid-state NanoporesProtein AdsorptionSingle-molecule MeasurementsNucleic AcidsProtein UnfoldingBinding AffinityResistive-pulse TechniqueLabeling-free MeasurementsTransmembrane PotentialAnalyte PartitioningNanopore WallsMicrofluidic DevicesProtein Binding AssayNitride FilmsThin FilmsFunctionalized SurfacesDenaturing Conditions
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Citazione di questo articolo
Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560, doi:10.3791/3560 (2011).
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