JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

ソリッドステートナノ細孔を持つ監視タンパク質吸着

Published: December 02, 2011
doi:
10.3791/3560
,
1Department of Physics,Syracuse University

Summary

無機表面へのタンパク質の非特異的吸着を監視するための固体ナノ細孔を用いる方法が説明されています。方法は、リアルタイムで、単一分子レベルで検出対象にする吸着を可能に、抵抗パルスの原理を採用しています。単一タンパク質吸着のプロセスがはるかに平衡からなので、我々は同様にタンパク質吸着の定数見かけ一次反応速度の定量測定と一定のラングミュア吸着のために可能にする、合成ナノ細孔の並列配列の雇用を提案する。

Abstract

ソリッドステートナノ細孔は、局所構造と柔軟性核酸1-6、タンパク質7の展開、および異なるリガンド8の結合親和性を調べるために、単一分子レベルでの測定を実行するために使用されている。 9月12日の抵抗のパルステクニックにこれらのナノ細孔を結合することによって、そのような測定は、様々な条件の下でとラベリング3を必要とせずに行うことができます。抵抗 – パルス法では、イオン性塩溶液は、ナノ細孔の両側に導入されています。したがって、イオンは定常電流、その結果、適用される膜内外電位差によってチャンバの一方から他方に駆動されています。ナノ細孔への分析対象物の分割は、単一分子情報を抽出するために分析することができる、この電流で明確に定義されたたわみを、引き起こす。このテクニックを使用して、ナノ細孔壁への単一のタンパク質の吸着は、広い範囲の下で監視することができます条件13。マイクロ流体デバイスのサイズが縮小として、単一のタンパク質とこれらのシステムの相互作用が問題となるので、タンパク質の吸着は、重要性が高まっています。このプロトコルは、容易にナノ細孔の掘削の影響を受けやすい他の薄膜、するか、官能窒化物の表面に拡張することができる窒化膜への結合タンパク質の迅速なアッセイについて説明します。タンパク質の様々なソリューションと変性条件の広い範囲で検討されることがあります。また、このプロトコルは、ナノ細孔の分光法を用いてより多くの基本的な問題を探求するために使用されることがあります。

Protocol

1。シリコン窒化膜の固体ナノ細孔の製造 200 kVの加速電圧にFEI Tecnai F20のS / TEMをもたらす。別のS / TEMを使用している場合、加速電圧はkVの9より200以上でなければなりません TEM試料ホルダに20nmの厚SPI窒化ケイ素のウィンドウのグリッドをロードして、ホルダーからの汚染物質を取り除くために30秒間酸素プラズマでクリーニング。 S / TEMにサンプルをロードし、?…

Discussion

固体表面へのタンパク質の自発的な吸着27-29などのバイオチップのアプリケーションと機能的なハイブリッド生体材料の新しいクラスの設計などの分野の数が、根本的に重要である。これまでの研究では、固体表面に吸着した蛋白質は、横方向の移動性または重要な脱着率が表示されないことが示されているため、タンパク質の吸着は、一般的に不可逆と非特異的なプロセス30か?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は彼らのアドバイスをジョンGrazul（コーネル大学）、アンドレMarziali（バンクーバーでのブリティッシュコロンビア大学）とヴィンセントタバード-コッサが（オタワ大学）に感謝いたします。この作品は、米国国立科学財団（DMR – 0706517とDMR – 1006332）と国立衛生研究所（R01 – GM088403）からの補助金によって一部で賄われている。材料研究科学工学センター（MRSEC）プログラム（DMR 0520404） – ナノ細孔の掘削は、全米科学財団からの支援と材料研究のためのコーネルセンター（CCMR）の電子顕微鏡施設で行われました。シリコン窒化膜の調製は、国立科学財団（助成ECS – 0335765）でサポートされているコーネルナノスケール施設、国家ナノテクノロジーインフラネットワークのメンバー、で行った。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Tecnai F20 S/TEM FEI   S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source.
20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM SPI 4163SN-BA  
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices    
Axon Digidata 1440A Molecular Devices    
pCLAMP 10 software Molecular Devices   Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software
Sulfuric Acid Fisher Scientific A300  
hydrogen peroxide Fisher Scientific H325  
silicone O-rings McMaster-Carr 003 S70 Alternatively use PDMS
silver wire Sigma-Aldrich 348759 For electrodes
SPC Technology, D sub contact, pin Newark 9K4978 For electrodes
potassium chloride Sigma P9541  
potassium phosphate dibasic Sigma P2222  
potassium phosphate monobasic Sigma P5379  
PDMS Dow Corning   Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber.
Kwik-Cast Sealant World Precision Instruments KWIK-CAST Fast acting silicone sealant
hot plate Fisher Scientific    
Faraday cage      
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
  2. Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
  3. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).
  4. Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
  5. Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
  6. Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
  7. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
  8. Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
  9. Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
  10. Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
  11. Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature’s way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
  12. Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
  13. Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
  14. Wanunu, M., Meller, A., Selvin, P. R., Ha, T. . Single-molecule techniques: a laboratory manual. , 395-420 (2008).
  15. Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
  16. Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
  17. Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
  18. Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. , (2010).
  19. Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
  20. Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. , (2011).
  21. Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
  22. Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
  23. Wanunu, M., Meller, A. Chemically modified solid-state nanopores. Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).
  24. Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
  25. Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
  26. Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
  27. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
  28. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
  29. Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
  30. Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
  31. Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
  32. Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
  33. Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
  34. Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy ‘windows’ for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
  35. Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
  36. Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
  37. Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
  38. Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
  39. Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
  40. Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. , (2009).
  41. Kim, M. -. J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
  42. Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).

Tags

Solid-state NanoporesProtein AdsorptionSingle-molecule MeasurementsNucleic AcidsProtein UnfoldingBinding AffinityResistive-pulse TechniqueLabeling-free MeasurementsTransmembrane PotentialAnalyte PartitioningNanopore WallsMicrofluidic DevicesProtein Binding AssayNitride FilmsThin FilmsFunctionalized SurfacesDenaturing Conditions
check_url/it/3560?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560, doi:10.3791/3560 (2011).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image