رصد بروتين الامتزاز مع الحالة الصلبة Nanopores
Summary
ووصف طريقة استخدام الحالة الصلبة nanopores لرصد الامتزاز غير محدد من البروتينات على سطح غير العضوية. الأسلوب يعمل على مبدأ مقاوم النبض ، مما يسمح للامتزاز أن يكون بحث في الوقت الحقيقي وعلى مستوى واحد جزيء. لأن عملية امتصاص البروتين وحيد هو أبعد ما يكون عن التوازن ، نقترح العمل صفائف متوازي من nanopores الاصطناعية ، وتمكين لتحديد كمي لمعدل أول رد فعل واضح ترتيب ثابت الامتزاز البروتين وكذلك وانجميور ثابت الامتزاز.
Abstract
وقد استخدمت الحالة الصلبة nanopores لتنفيذ القياسات على مستوى واحد جزيء لدراسة هيكل المحلي ومرونة من الأحماض النووية 1-6 ، وتتكشف من البروتينات 7 ، وتقارب ملزم من يغاندس مختلفة 8. وذلك بربط هذه nanopores لأسلوب مقاوم النبض 12/09 ، يمكن القيام به مثل هذه القياسات في إطار مجموعة واسعة من الظروف ودون الحاجة لوضع العلامات 3. في أسلوب مقاوم ، النبض ، وقدم حلا الملح الأيونية على كلا الجانبين من nanopore. لذلك ، هي التي تحرك الأيونات من جانب واحد من غرفة الى أخرى محتملة عبر الغشاء قبل تطبيقها ، مما أدى إلى تيار ثابت. تقسيم لتحليلها في nanopore يؤدي إلى انحراف واضحة المعالم في هذا التيار ، والتي يمكن تحليلها لاستخلاص المعلومات جزيء واحد. باستخدام هذه التقنية ، يمكن رصد امتصاص البروتينات واحدة في الجدران nanopore في إطار مجموعة واسعة منالظروف 13. البروتين الامتزاز تزداد أهمية ، لأنه كما يتقلص الأجهزة ميكروفلويديك في حجمها ، والتفاعل بين هذه الأنظمة مع البروتينات واحد يصبح مصدرا للقلق. يصف هذا بروتوكول الفحص السريع للبروتين ملزمة لنيتريد الأفلام ، والتي يمكن بسهولة أن تمتد إلى غيرها من الأفلام رقيقة قابلة للحفر nanopore ، أو على الأسطح نيتريد functionalized. ويمكن استكشاف مجموعة متنوعة من البروتينات في إطار مجموعة واسعة من الحلول وتغيير طبيعة الظروف. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لاستكشاف المزيد من المشاكل الأساسية باستخدام nanopore الطيفي.
Protocol
Discussion
الامتزاز عفوية من البروتينات على السطوح الصلبة للدولة 27-29 أهمية أساسية في عدد من المجالات ، مثل تطبيقات biochip وتصميم فئة جديدة من المواد الحيوية هجينة وظيفية. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن البروتينات كثف إلى الحالة الصلبة السطوح لا تظهر التنقل الأفقي أو معدلات ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر جون Grazul (جامعة كورنيل) ، اندريه Marziali (جامعة كولومبيا البريطانية في فانكوفر) وفنسنت الطبرد – كوسا (جامعة أوتاوا) لنصائحهم. ويتم تمويل هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (DMR – 0706517 و 1006332 DMR -) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 – GM088403). تم تنفيذ حفر nanopore في مرفق المجهر الإلكتروني لمركز كورنيل للبحوث المواد (CCMR) بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم — علوم المواد والهندسة مراكز البحوث (MRSEC) برنامج (DMR 0520404). تم تنفيذ إعداد الأغشية نيتريد السيليكون في مرفق كورنيل النانومترية الحجم ، وعضوا في شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية ، وهو مدعوم من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (المنح ECS – 0335765).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
| 20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
| silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
| SPC Technology, D sub contact, pin | Newark | 9K4978 | For electrodes |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | P2222 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
| hot plate | Fisher Scientific | ||
| Faraday cage |
Riferimenti
- Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
- Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
- Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).
- Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
- Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
- Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
- Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
- Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
- Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
- Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature’s way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
- Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
- Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
- Wanunu, M., Meller, A., Selvin, P. R., Ha, T. . Single-molecule techniques: a laboratory manual. , 395-420 (2008).
- Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
- Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
- Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
- Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. , (2010).
- Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
- Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. , (2011).
- Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
- Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
- Wanunu, M., Meller, A. Chemically modified solid-state nanopores. Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).
- Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
- Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
- Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
- Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
- Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
- Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
- Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
- Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
- Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
- Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
- Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy ‘windows’ for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
- Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
- Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
- Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
- Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
- Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
- Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. , (2009).
- Kim, M. -. J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
- Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).
