Surveillance des protéines par adsorption à semi-conducteurs Nanopores
Summary
Une méthode d'utilisation de l'état solide nanopores pour surveiller l'adsorption non-spécifique de protéines sur une surface inorganique est décrite. La méthode utilise le principe résistif impulsion, permettant à l'adsorption à sonder en temps réel et à la molécule seul niveau. Parce que le processus d'adsorption est seule protéine loin de l'équilibre, nous proposons l'emploi de réseaux parallèles de nanopores de synthèse, permettant pour la détermination quantitative du taux de réaction de premier ordre apparent constant de l'adsorption des protéines ainsi que l'adsorption de Langmuir et les constantes.
Abstract
Solid-state nanopores ont été utilisés pour effectuer des mesures au niveau molécule unique d'examiner la structure locale et la flexibilité des acides nucléiques 1-6, le déroulement des protéines 7, et l'affinité de liaison des ligands différents 8. En couplant ces nanopores à la technique résistive impulsion 9-12, de telles mesures peut être faite sous une grande variété de conditions et sans la nécessité d'un étiquetage 3. Dans la technique résistive impulsions, une solution de sel ionique est introduite des deux côtés de la nanopore. Par conséquent, les ions sont entraînés par un côté de la chambre à l'autre par un potentiel transmembranaire appliquée, résultant en un courant stable. Le partitionnement d'un analyte dans le nanopore provoque une déviation bien définie dans ce courant, qui peuvent être analysés pour en extraire une seule molécule d'informations. En utilisant cette technique, l'adsorption de certaines protéines sur les parois nanopore peut être contrôlé dans une large gamme deconditions 13. L'adsorption des protéines gagne en importance, parce que les dispositifs microfluidiques diminuer en taille, l'interaction de ces systèmes avec des protéines unique devient une préoccupation. Ce protocole décrit un test rapide pour la protéine de liaison à des films de nitrure, qui peut être facilement étendu à d'autres films minces se prêtent au forage nanopore, ou sur des surfaces de nitrure fonctionnalisés. Une variété de protéines peuvent être explorés dans une large gamme de solutions et de conditions de dénaturation. En outre, ce protocole peut être utilisé pour explorer plus de problèmes de base en utilisant la spectroscopie nanopore.
Protocol
Discussion
Spontanée adsorption des protéines sur des surfaces semi-conducteurs de 27 à 29 est fondamentalement important dans un certain nombre de domaines, tels que les applications de biopuces et la conception d'une nouvelle classe de biomatériaux hybrides fonctionnels. Des études antérieures ont montré que les protéines adsorbées sur des surfaces semi-conducteurs ne montrent pas la mobilité latérale ou les taux de désorption significative, et donc l'adsorption des protéines est généralement co…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier John Grazul (Cornell University), André Marziali (L'Université de la Colombie-Britannique à Vancouver) et Vincent Tabard-Cossa (L'Université d'Ottawa) pour leurs conseils. Ce travail est financé en partie par des subventions de la National Science Foundation américaine (DMR-0706517 et DMR-1006332) et le National Institutes of Health (R01-GM088403). Le forage a été effectué nanopore à l'installation de microscopie électronique du Centre de Cornell pour la recherche sur les matériaux (CCMR) avec le soutien de la National Science Foundation – la recherche en sciences des matériaux et centres d'ingénierie (MRSEC) programme (DMR 0520404). La préparation des membranes de nitrure de silicium a été réalisée à la Cornell facilité l'échelle nanométrique, un membre du Réseau National Nanotechnology Infrastructure, qui est soutenu par la National Science Foundation (Grant ECS-0335765).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
| 20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
| silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
| SPC Technology, D sub contact, pin | Newark | 9K4978 | For electrodes |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | P2222 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
| hot plate | Fisher Scientific | ||
| Faraday cage |
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