Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen
Summary
Eine Methode der Verwendung von Solid-State-Nanoporen, die unspezifische Adsorption von Proteinen auf einer anorganischen Oberfläche überwachen beschrieben. Die Methode nutzt die resistive-Puls-Prinzip, so dass für die Adsorption in Echtzeit und in der Einzel-Molekül-Ebene untersucht werden. Da der Prozess der einzelnen Protein-Adsorption ist fern vom Gleichgewicht, schlagen wir den Einsatz von parallel Arrays von synthetischen Nanoporen, so dass für die quantitative Bestimmung der scheinbaren Reaktion erster Ordnung Geschwindigkeitskonstante der Proteinadsorption sowie die Langmuir Adsorption konstant.
Abstract
Solid-State-Nanoporen wurden genutzt, um Messungen an der Einzel-Molekül-Ebene durchzuführen, um die lokale Struktur und Flexibilität von Nukleinsäuren 1-6, die Entfaltung von Proteinen 7 und Bindungsaffinität unterschiedlicher Liganden 8 zu untersuchen. Durch die Kopplung dieser Nanoporen der resistiven-Puls-Technik 9-12, können solche Messungen unter einer Vielzahl von Bedingungen und ohne die Notwendigkeit für die Kennzeichnung 3 durchgeführt werden. In der resistive-Puls-Technik ist ein ionisches Salz-Lösung auf beiden Seiten des Nanopore eingeführt. Daher werden die Ionen von einer Seite der Kammer in die andere durch eine angelegte Transmembranpotential getrieben, was zu einem stetigen Strom. Die Aufteilung eines Analyten in die Nanopore Ursachen einer gut definierten Auslenkung in diesem Strom, der analysiert, um Einzel-Molekül-Informationen zu extrahieren können. Mit dieser Technik kann die Adsorption von einzelnen Proteinen, die Nanopore Wänden unter einer Vielzahl von überwacht werdenBedingungen 13. Proteinadsorption an Bedeutung, weil sie als mikrofluidischen Bauteilen in der Größe schrumpfen, wird die Wechselwirkung dieser Systeme mit einzelne Proteine ein Anliegen. Dieses Protokoll beschreibt einen Schnelltest zur Proteinbindung an Nitrid-Filme, die ohne weiteres auf andere dünne Filme zugänglich Nanopore Bohren oder zu funktionalisierten Oberflächen-Nitrid verlängert werden kann. Eine Vielzahl von Proteinen kann unter einer Vielzahl von Lösungen und denaturierenden Bedingungen untersucht werden. Darüber hinaus kann dieses Protokoll verwendet werden, um mehr grundsätzliche Probleme mit Nanopore-Spektroskopie zu erkunden.
Protocol
Discussion
Spontane Adsorption von Proteinen an Festkörperoberflächen 27-29 ist von fundamentaler Bedeutung in einer Reihe von Bereichen, wie Biochip-Anwendungen und Design einer neuen Klasse von funktionellen Biomaterialien Hybrid. Frühere Studien haben gezeigt, dass Proteine adsorbiert Festkörperoberflächen zeigen keine seitliche Beweglichkeit oder signifikante Desorptionsraten, und deshalb Proteinadsorption ist in der Regel eine irreversible und unspezifische Prozess 30-32 betrachtet. Protein-Ad…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei John Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia in Vancouver) und Vincent Tabard-Cossa (The University of Ottawa) für ihre Ratschläge danken. Diese Arbeit wird zum Teil durch Zuschüsse aus dem US-amerikanischen National Science Foundation (DMR-0706517 und DMR-1006332) und die National Institutes of Health (R01-GM088403) finanziert. Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC) Programm (DMR 0520404) – Die Nanopore Bohrungen wurden in der Elektronenmikroskopie Facility of the Cornell Center for Materials Research (CCMR) mit Unterstützung der National Science Foundation durchgeführt. Die Aufstellung von Siliziumnitrid-Membranen wurde an der Cornell NanoScale Facility, ein Mitglied der National Nanotechnology Infrastructure Network, das von der National Science Foundation (Grant ECS-0335765) unterstützt wird durchgeführt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
| 20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
| silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
| SPC Technology, D sub contact, pin | Newark | 9K4978 | For electrodes |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | P2222 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
| hot plate | Fisher Scientific | ||
| Faraday cage |
Riferimenti
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