חלבון ניטור ספיחה עם מצב מוצק nanopores
Summary
השיטה של שימוש מצב מוצק nanopores לפקח על הלא ספציפית ספיחה של חלבונים על פני השטח אורגניים מתואר. השיטה משתמשת בעיקרון דופק-התנגדות, ומאפשר ספיחה להיות נחקר בזמן אמת והן ברמת מולקולה בודדת. בגלל תהליך ספיחה של חלבון יחיד רחוק שיווי משקל, אנו מציעים את העסקתם של מערכים מקבילים של nanopores סינתטי, מה שמאפשר לקביעת כמותית של קצב מסדר ראשון נראית לעין תגובה קבועה של חלבון ספיחה, כמו גם את לאנגמיור ספיחה מתמדת.
Abstract
מצב מוצק nanopores שימשו כדי לבצע מדידות ברמת יחיד המולקולה לבחון את מבנה הגמישות המקומית של חומצות גרעין 1-6, את התגלגלות של חלבונים 7, זיקה מחייבת של ligands שונים 8. על ידי צימוד אלה nanopores לטכניקה הדופק התנגדות, 12/09, מדידות כאלה ניתן לעשות זאת תחת מגוון רחב של מצבים רחב ללא צורך תיוג 3. בטכניקה התנגדות, דופק, פתרון מלח יוניים הוא הציג על שני הצדדים של nanopore. לכן, יונים מונעים מצד אחד של החדר לצד השני על ידי פוטנציאל הטרנסממברני מיושם, וכתוצאה מכך זרם יציב. חלוקת אנליטי לתוך nanopore גורמת סטיה מוגדרת היטב בזרם זה, אשר ניתן לנתח כדי לחלץ מידע יחיד מולקולה. באמצעות טכניקה זו, ספיחה של חלבונים יחיד על הקירות nanopore יכול להיות פיקוח תחת מגוון רחב שלהתנאים 13. חלבון ספיחה גוברת בחשיבותו, כי כמו מכשירים microfluidic לכווץ בגודל, את האינטראקציה של מערכות אלה עם חלבונים יחיד הופך לדאגה. פרוטוקול זה מתאר assay מהיר של חלבון מחייב סרטים ניטריד, אשר יכול בקלות להיות מורחבת סרטים דקים אחרים מקובל קידוח nanopore, או משטחים ניטריד פונקציונליות. מגוון של חלבונים עלול להיחקר תחת מגוון רחב של פתרונות ותנאי denaturing. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור יותר בעיות בסיסיות באמצעות ספקטרוסקופיית nanopore.
Protocol
Discussion
ספיחה ספונטנית של חלבונים על מצב מוצק משטחים 27-29 חשוב ביסודו במספר תחומים, כגון יישומים biochip ועיצוב של מעמד חדש של biomaterials היברידית תפקודית. מחקרים קודמים הראו כי חלבונים adsorbed כדי מצב מוצק משטחים לא מראים הניידות לרוחב או שיעורי desorption משמעותי, ולכן חלבון ספיחה נח…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ג'ון Grazul (אוניברסיטת קורנל), אנדרה Marziali (האוניברסיטה של קולומביה הבריטית ונקובר ב) ו – וינסנט התחפושת-Cossa (מאוניברסיטת אוטווה) עבור עצתם. עבודה זו ממומנת בחלקה על ידי תרומות של המוסד האמריקני למדע (DMR-0706517 ו DMR-1006332) לבין המכון הלאומי לבריאות (R01-GM088403). הקידוח nanopore בוצעה במתקן מיקרוסקופית אלקטרונים מרכז קורנל עבור חומרים מחקר (CCMR) בתמיכת הקרן הלאומית למדע – חומרים מדע והנדסה מרכזי מחקר (MRSEC) בתוכנית (DMR 0,520,404). הכנה של ממברנות סיליקון ניטריד בוצעה במתקן ננו קורנל, חבר של רשת ננוטכנולוגיה התשתיות הלאומיות, אשר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק ECS-0335765).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
| 20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
| silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
| SPC Technology, D sub contact, pin | Newark | 9K4978 | For electrodes |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | P2222 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
| hot plate | Fisher Scientific | ||
| Faraday cage |
Riferimenti
- Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
- Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
- Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).
- Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
- Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
- Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
- Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
- Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
- Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
- Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature’s way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
- Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
- Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
- Wanunu, M., Meller, A., Selvin, P. R., Ha, T. . Single-molecule techniques: a laboratory manual. , 395-420 (2008).
- Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
- Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
- Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
- Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. , (2010).
- Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
- Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. , (2011).
- Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
- Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
- Wanunu, M., Meller, A. Chemically modified solid-state nanopores. Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).
- Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
- Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
- Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
- Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
- Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
- Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
- Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
- Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
- Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
- Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
- Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy ‘windows’ for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
- Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
- Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
- Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
- Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
- Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
- Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. , (2009).
- Kim, M. -. J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
- Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).
