ठोस राज्य nanopores के साथ निगरानी प्रोटीन सोखना
Summary
ठोस राज्य nanopores का उपयोग करने के लिए एक अकार्बनिक सतह पर प्रोटीन की गैर विशिष्ट सोखना की निगरानी की एक विधि वर्णित है. विधि प्रतिरोधक – नाड़ी सिद्धांत को रोजगार, सोखना के लिए अनुमति देने के लिए वास्तविक समय में और एकल अणु स्तर पर जांच होनी है. क्योंकि एकल प्रोटीन सोखना के प्रक्रिया संतुलन से दूर है, हम सिंथेटिक nanopores के समानांतर arrays के रोजगार का प्रस्ताव, पहले के आदेश स्पष्ट प्रतिक्रिया प्रोटीन सोखना के निरंतर दर के मात्रात्मक निर्धारण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से और Langmuir सोखना निरंतर के लिए सक्षम करने.
Abstract
ठोस राज्य nanopores nucleic एसिड की स्थानीय संरचना और लचीलापन 1-6, 7 प्रोटीन का खुलासा, और अलग अलग 8 ligands के बंधन आत्मीयता की जांच के एकल अणु स्तर पर माप प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. प्रतिरोधक नाड़ी 9-12 तकनीक इन nanopores युग्मन, इस तरह के मापन की शर्तों के एक विस्तृत विविधता के अंतर्गत और 3 लेबलिंग के लिए आवश्यकता के बिना किया जा सकता है. प्रतिरोधक पल्स तकनीक में, एक ईओण नमक समाधान nanopore के दोनों पक्षों पर शुरू की है. इसलिए, आयनों एक आवेदन transmembrane क्षमता द्वारा चैम्बर के एक तरफ से दूसरे को प्रेरित कर रहे हैं, एक स्थिर वर्तमान में जिसके परिणामस्वरूप. nanopore में एक analyte के विभाजन के इस वर्तमान में एक अच्छी तरह से परिभाषित विक्षेपन, जो एकल अणु जानकारी निकालने के लिए विश्लेषण किया जा सकता का कारण बनता है. इस तकनीक का उपयोग करना, सोखना nanopore दीवारों एकल प्रोटीन के एक विस्तृत श्रृंखला के तहत नजर रखी जा सकती13 शर्तों. प्रोटीन सोखना महत्व में बढ़ रहा है, क्योंकि microfluidic उपकरणों के रूप में आकार में छोटा है, एक प्रोटीन के साथ इन प्रणालियों की बातचीत एक चिंता का विषय बन जाता है. इस प्रोटोकॉल नाइट्राइड फिल्मों, जो आसानी से nanopore ड्रिलिंग करने के लिए उत्तरदायी अन्य पतली फिल्मों, या functionalized नाइट्राइड सतहों के लिए बढ़ाया जा सकता है के लिए बाध्य प्रोटीन के लिए एक तेजी से परख का वर्णन करता है. प्रोटीन की एक किस्म के समाधान और denaturing स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत पता लगाया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल के लिए अधिक बुनियादी nanopore स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर समस्याओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Discussion
ठोस राज्य 27-29 सतहों पर प्रोटीन की स्वतःस्फूर्त सोखना biochip अनुप्रयोगों और कार्यात्मक संकर biomaterials के एक नए वर्ग के डिजाइन के रूप में ऐसे क्षेत्रों की संख्या में मूल रूप से महत्वपूर्ण है. पिछले अध्ययनों स…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank John Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia at Vancouver) and Vincent Tabard-Cossa (The University of Ottawa) for their advice. This work is funded in part by grants from the US National Science Foundation (DMR-0706517 and DMR-1006332) and the National Institutes of Health (R01-GM088403). The nanopore drilling was performed at the Electron Microscopy Facility of the Cornell Center for Materials Research (CCMR) with support from the National Science Foundation – Materials Research Science and Engineering Centers (MRSEC) program (DMR 0520404). The preparation of the silicon nitride membranes was performed at the Cornell NanoScale Facility, a member of the National Nanotechnology Infrastructure Network, which is supported by the National Science Foundation (Grant ECS-0335765).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
| 20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
| silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
| SPC Technology, D sub contact, pin | Newark | 9K4978 | For electrodes |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | P2222 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
| hot plate | Fisher Scientific | ||
| Faraday cage |
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