En metode for å bruke solid-state nanopores å overvåke non-spesifikk adsorpsjon av proteiner på et uorganisk overflaten er beskrevet. Metoden benytter resistive-pulsen prinsippet, noe som åpner for adsorpsjon å bli analysert i sanntid og på enkelt-molekyl nivå. Fordi prosessen med singel protein adsorpsjon er langt fra likevekt, foreslår vi ansettelse av parallelle rekker av syntetiske nanopores, slik for kvantitativ måling av den tilsynelatende første orden reaksjon hastighetskonstanten av protein adsorpsjon samt og Langmuir adsorpsjon konstant.
Solid-state nanopores har blitt brukt til å utføre målinger på enkelt-molekyl nivå for å undersøke den lokale struktur og fleksibilitet av nukleinsyrer 1-6, utfoldelsen av proteiner 7, og Bindingsaffinitet av forskjellige ligander 8. Ved kobling disse nanopores til resistive-pulsen teknikk 9-12, kan slike målinger gjøres under en rekke forutsetninger og uten behov for merking 3. I den resistive-puls teknikk, er en ionisk salt løsning introdusert på begge sider av nanopore. Derfor er ioner drevet fra den ene siden av kammeret til den andre ved et anvendt transmembrane potensial, som resulterer i en jevn strøm. Den oppdeling av en analytt i nanopore forårsaker en veldefinert avbøyning i denne strømmen, som kan analyseres for å trekke single-molekyl informasjon. Ved hjelp av denne teknikken kan adsorpsjon av single proteiner til nanopore veggene overvåkes under et bredt spekter avforhold 13. Protein adsorpsjon vokser i betydning, fordi som microfluidic enheter krympe i størrelse, blir samspillet mellom disse systemene med én proteiner en bekymring. Denne protokollen beskriver en rask test for protein binding til nitride filmer, som lett kan utvides til andre tynne filmer mottagelig for nanopore boring, eller å functionalized nitride overflater. En rekke proteiner kan utforskes under et bredt spekter av løsninger og denaturering forhold. I tillegg kan denne protokollen brukes til å utforske mer grunnleggende problemer ved hjelp nanopore spektroskopi.
Spontan adsorpsjon av proteiner på solid-state overflater 27-29 er fundamentalt viktig i en rekke områder, slik som biochip applikasjoner og design av en ny klasse av funksjonelle hybrid biomaterialer. Tidligere studier har vist at proteiner adsorberes til solid-state overflater ikke viser lateral mobilitet eller signifikant desorpsjon priser, og derfor protein adsorpsjon er generelt ansett som en irreversibel og ikke-spesifikk prosess 30-32. Protein adsorpsjon på solid state overflater antas å…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke John Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia i Vancouver) og Vincent Tabard-Cossa (The University of Ottawa) for deres råd. Dette arbeidet er finansiert delvis med tilskudd fra det amerikanske National Science Foundation (DMR-0706517 og DMR-1006332) og National Institutes of Health (R01-GM088403). Den nanopore Boringen ble utført ved Elektronmikroskopi Facility av Cornell Center for Materials Research (CCMR) med støtte fra National Science Foundation – Materials Research Science and Engineering Centers (MRSEC) program (DMR 0.520.404). Utarbeidelsen av silisiumnitrid membranene ble utført ved Cornell nanoskala Facility, et medlem av National Nanoteknologi Infrastructure Network, som er støttet av National Science Foundation (Grant ECS-0335765).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI | 4163SN-BA | |
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
SPC Technology, D sub contact, pin | Newark | 9K4978 | For electrodes |
potassium chloride | Sigma | P9541 | |
potassium phosphate dibasic | Sigma | P2222 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
hot plate | Fisher Scientific | ||
Faraday cage |