Monitoramento adsorção de proteínas com Solid-state Nanoporos
Summary
Um método de usar solid-state nanoporos para monitorar a adsorção não-específica de proteínas em uma superfície inorgânica é descrita. O método emprega o princípio de pulso-resistivo, permitindo a adsorção a ser sondado em tempo real e ao nível de moléculas individuais. Porque o processo de adsorção de proteínas é única longe do equilíbrio, propomos o emprego de matrizes paralelas de nanoporos sintéticos, permitindo que para a determinação quantitativa da taxa de reação aparente de primeira ordem constante de adsorção de proteínas, assim como o de adsorção de Langmuir e constante.
Abstract
Solid-state nanoporos têm sido utilizados para realizar as medições ao nível única molécula para examinar a estrutura local e flexibilidade de ácidos nucléicos 1-6, o desdobramento de proteínas 7 e afinidade de ligação de ligantes diferentes 8. Ao unir esses nanoporos à técnica de pulso-resistivo 9-12, tais medições pode ser feito sob uma ampla variedade de condições e sem a necessidade de rotulagem 3. Na técnica de resistência de pulso, uma solução de sal iônico é introduzido em ambos os lados do nanopore. Portanto, os íons são levados de um lado da câmara para o outro por um potencial transmembrana aplicada, resultando em uma corrente constante. O particionamento de um analito na nanopore provoca uma deflexão bem definidas nesta corrente, que pode ser analisado para extrair informação única molécula. Usando esta técnica, a adsorção de proteínas único para as paredes nanopore pode ser monitorado em uma ampla gama decondições 13. Adsorção de proteínas está crescendo em importância, porque, como dispositivos microfluídicos encolher de tamanho, a interação destes sistemas com proteínas simples se torna uma preocupação. Este protocolo descreve um ensaio rápido para a proteína de ligação aos filmes de nitreto, que pode ser facilmente alargada a outros filmes finos passíveis de perfuração nanopore, ou em superfícies de nitreto de funcionalizados. A variedade de proteínas pode ser explorado sob uma ampla gama de soluções e condições de desnaturação. Além disso, este protocolo pode ser usado para explorar mais problemas básicos usando espectroscopia nanopore.
Protocol
Discussion
Adsorção espontânea de proteínas em estado sólido superfícies 27-29 é de fundamental importância em várias áreas, tais como aplicações biochip e design de uma nova classe de biomateriais híbridos funcionais. Estudos anteriores mostraram que as proteínas adsorvidas para solid-state superfícies não apresentam mobilidade lateral ou taxas de dessorção significativa e, portanto, adsorção de proteínas é geralmente considerado um processo irreversível e inespecífico 30-32. Adsorç?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a John Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia em Vancouver) e Vincent Tabard-Cossa (The University of Ottawa) para os seus conselhos. Este trabalho é financiado em parte por concessões do National Science Foundation EUA (DMR-0706517 e DMR-1006332) e pelo National Institutes of Health (R01-GM088403). A perfuração nanopore foi realizada no Centro de Microscopia Eletrônica do Centro Cornell de Pesquisa de Materiais (CCMR) com o apoio da National Science Foundation – Ciência dos Materiais de Pesquisa e Centros de Engenharia de programa (MRSEC) (DMR 0.520.404). A preparação das membranas de nitreto de silício foi realizada no Centro de Cornell em nanoescala, um membro da Rede Nacional de Nanotecnologia Infra-estrutura, que é apoiado pela National Science Foundation (Grant ECS-0335765).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
| 20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
| silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
| SPC Technology, D sub contact, pin | Newark | 9K4978 | For electrodes |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | P2222 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
| hot plate | Fisher Scientific | ||
| Faraday cage |
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