Un metodo di utilizzo allo stato solido nanopori per monitorare la non-specifico di assorbimento delle proteine su una superficie inorganica viene descritta. Il metodo impiega il resistivo impulsi principio, consentendo l'assorbimento di essere sondato in tempo reale e al livello di singola molecola. Poiché il processo di assorbimento delle proteine singolo è lontano dall'equilibrio, proponiamo l'impiego di matrici parallele di nanopori sintetici, permettendo per la determinazione quantitativa del primo ordine apparente velocità di reazione costante assorbimento di proteine, nonché e il Langmuir adsorbimento costante.
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Articolo metodologico
Monitoraggio delle proteine con a stato solido Nanopori
In questo articolo
Sommario
Abstract
A stato solido nanopori sono stati utilizzati per eseguire misure a livello di singola molecola per esaminare la struttura locale e la flessibilità degli acidi nucleici 1-6, lo svolgimento delle proteine 7 e affinità di legame di ligandi diversi 8. Accoppiando questi nanopori alla tecnica resistivo impulsi 9-12, tali misure può essere effettuata sotto una grande varietà di condizioni e senza la necessità di etichettatura 3. Nel resistivo impulsi tecnica, una soluzione di sale ionico viene introdotto su entrambi i lati del nanoporo. Pertanto, gli ioni sono guidate da un lato all'altro della camera all'altra da un potenziale transmembrana applicata, determinando una corrente costante. Il partizionamento di un analita nel nanoporo provoca una deflessione ben definito in questa corrente, che possono essere analizzati per estrarre singola molecola informazioni. Utilizzando questa tecnica, l'adsorbimento di singole proteine alle pareti nanoporo può essere monitorato con una vasta gamma dicondizioni 13. Delle proteine è sempre più importante, perché come dispositivi microfluidici ridursi in dimensione, l'interazione di questi sistemi con le proteine singolo diventa un problema. Questo protocollo descrive un test rapido per la proteina legante ai film nitrati, che possono facilmente essere estesa ad altri film sottili suscettibili di foratura nanoporo, o di nitruro di superfici funzionalizzate. Una varietà di proteine può essere esplorato in un'ampia gamma di soluzioni e condizioni di denaturazione. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per esplorare più problemi di base utilizzando la spettroscopia nanoporo.
Protocollo
1. Produzione di stato solido nanopori nelle membrane di nitruro di silicio
- Portare la FEI Tecnai F20 S / TEM ad una tensione di accelerazione di 200 kV. Se si utilizza un diverso S / TEM, la tensione di accelerazione deve essere maggiore o uguale a 200 kV 9
- Carica un 20 nm di spessore SPI griglia di nitruro di silicio finestra nel porta-campione TEM e pulite, con plasma di ossigeno per 30 secondi per rimuovere eventuali contaminanti dal supporto.
- Caricare il campione in S / TEM e consentire la pompa a vuoto verso il basso. Una volta che il S / TEM ha pompato fino a vuoto, la finestra di nitruro di trovare in campo chiaro mod....
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Discussione
Adsorbimento spontanea di proteine su superfici a stato solido 27-29 è di fondamentale importanza in numerosi settori, quali le applicazioni biochip e la progettazione di una nuova classe di biomateriali funzionali ibride. Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine adsorbite a stato solido superfici non mostrano la mobilità laterale o tassi di desorbimento significative, e quindi delle proteine è generalmente considerato un processo irreversibile e non specifico 30-32. Delle proteine .......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Giovanni Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia a Vancouver) e Vincent Tabard-Cossa (Università di Ottawa) per i loro consigli. Questo lavoro è finanziato in parte da finanziamenti della US National Science Foundation (DMR-0706517 e DMR-1006332) e il National Institutes of Health (R01-GM088403). La foratura nanoporo è stata eseguita presso l'impianto di Microscopia Elettronica del Centro Cornell per i materiali di ricerca (CCMR) con il sostegno della National Science Foundation - Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC) programma (DMR 0520404). La preparazione di membrane ....
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Materiali
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Tecnai F20 S / TEM | FEI | S / TEM richiede una tensione di accelerazione ≥ fonte 200kV e campo di emissione. | |
| 20 nm di spessore della membrana finestra di nitruro di silicio per TEM | SPI | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplificatore | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Elettrofisiologia di acquisizione dati e analisi del software | |
| Acido solforico | Fisher scientifico | A300 | |
| perossido di idrogeno | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-ring | McMaster-Carr | 003 S70 | In alternativa utilizzare PDMS |
| Filo d'argento | Sigma-Aldrich | 348759 | Per elettrodi |
| SPC Technology, D-sub contatto, pin | Newark | 9K4978 | Per elettrodi |
| cloruro di potassio | Sigma | P9541 | |
| potassio fosfato bibasico | Sigma | P2222 | |
| potassio fosfato monobasico | Sigma | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Eelastomero set. Per fare da camera. | |
| Kwik-Cast Sigillante | Mondo Strumenti di precisione | KWIK-CAST | Veloce sigillante siliconico recitazione |
| piastra calda | Fisher Scientific | ||
| Gabbia di Faraday |
Riferimenti
- Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
- Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
- Dekker, C.
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Ristampe e permessi
