Modificeret Gær-Two-Hybrid system til at identificere Proteiner Interaktion med Growth Factor Progranulin

Summary

Vi har ændret det konventionelle gær to-hybrid screening, et effektivt genetisk redskab til at identificere protein interaktion. Denne ændring markant forkorter processen, reducerer arbejdsbyrden, og vigtigst, reducerer antallet af falske positiver. Hertil kommer, at denne tilgang reproducerbar og pålidelig.

Abstract

Progranulin (PGRN), også kendt som granulin epithelin forløber (GEP), er en 593-amino-syre autocrine vækstfaktor. PGRN er kendt for at spille en afgørende rolle i en række forskellige fysiologisk og sygdom processer, herunder tidlige embryogenese, sårheling ^1, inflammation ^{2, 3,} og vært forsvar ^4. PGRN fungerer også som en neurotrope faktor ^5, og mutationer i PGRN genet resulterer i en delvis tab af PGRN protein årsag frontotemporal demens ^{6, 7.} Vores seneste undersøgelser har ført til isolation af PGRN som en vigtig regulator af brusk udvikling og nedbrydning ^8-11. Selvom PGRN, opdagede næsten to årtier siden, spiller afgørende roller i flere fysiologiske og patologiske tilstande, indsatsen for at udnytte handlinger PGRN og forstå de involverede mekanismer er blevet hæmmet af vores manglende evne til at identificere dens bindende receptor (r). For at løse dette problem, har vi udviklet en modificerede gær to-hybrid (MY2H) tilgang baseret på de mest almindeligt anvendte GAL4 baseret 2-hybrid-system. Sammenlignet med de konventionelle gær to-hybrid-skærm, dramatisk MY2H forkorter skærmen processen og reducerer antallet af falsk positive kloner. Hertil kommer, at denne tilgang reproducerbar og pålidelig, og vi har med succes anvendt dette system i at isolere proteiner af forskellige lokkemad, herunder ion-kanal ^12, ekstracellulære matrix protein ^{10, 13,} og vækstfaktor ^14. I dette papir, beskriver vi denne MY2H eksperimentelle procedure i detaljer ved hjælp af PGRN som et eksempel, der førte til identifikationen af TNFR2 som den første kendte PGRN-associerede receptor ^{14, 15.}

Protocol

1. Baggrundsinformation Den gær to-hybrid-system er en stærk genetisk teknik, der bruges til at opdage protein-protein interaktioner 16, 17. Flere typer af 2-hybrid systemer, såsom Lexa-baserede systemer, SOS Rekruttering System, og bakterier-eller pattedyr celle-baseret 2-hybrider, der er kommercielt tilgængelige, dette dokument specifikt fokuseres på ændringer af de mest almindeligt anvendte GAL4 baseret gær 2-hybrid-system. Kort fortalt, er metoden baseret på egenskaberne…

Discussion

Gær to-hybrid screening har vist sig at være et effektivt redskab til at identificere protein interaktioner ^{16, 17.} Sammenlignet med andre metoder til at identificere proteinbindende partnere, såsom biokemiske co-rensning og protein chips, gær to-hybrid systemet er et følsomt genetisk tilgang, der kan bruges til screening meget stort antal kodningssekvenser i et relativt simpelt eksperiment, og i Desuden er det detekterer in vivo interaktion og behøver ikke kompliceret proteinoprensning. Selvfølgelig g…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
ProQuest two-hybrid system	Invitrogen	10835
YPD Growth Medium	Clontech	630409
YPD Agar Medium	Clontech	630410
Minimal SD agar Base	Clontech	630412
-Leu DO Supplement	Clontech	630414
-Leu/-Trp DO Supplement	Clontech	630417
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement	Clontech	630425
3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT)	Sigma-Aldrich	A8056
Luria broth (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
Sonicated Salmon Sperm DNA	Stratagene	201190
Ampicillin	AMRESCO	0339
Kanamycin Sulfate	Invitrogen	11815-024
Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells	Invitrogen	18265-017
Trizma® base	Sigma-Aldrich	T6066
Lithium acetate	Sigma-Aldrich	L4158
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	ED
Nitrocellulose Membrane	Bio-Rad	162-0115
10-cm petri dish	ITI Scientific	CT-903
Incubator (30 °C)	ATR (Ecotron)