Isolering av Mouse Lung dendrittiske celler
Summary
Et høyt renset utarbeidelse av mus lunge dendrittiske celler er beskrevet. Spesifikk vekt er gitt til isolering av konvensjonelle dendrittiske celle delmengden.
Abstract
Lung dendrittiske celler (DC) spiller en fundamental rolle i sensing invaderende patogener 1,2 samt kontroll av tolerogenic responser 3 i luftveiene. Minst tre undergrupper av lunge dendrittiske celler har blitt beskrevet i mus: konvensjonelle DC (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 og IFN-produserende drapsmann DC (IKDC) 6,7. CDC undergruppe er det mest fremtredende DC undergruppe i lungene 8.
Den vanlige markør kjent for å identifisere DC undergrupper er CD11c, en type jeg transmembrane integrin (β2) som også er uttrykt på monocytter, makrofager, nøytrofile granulocytter og enkelte B-celler 9. I noen vev, ved hjelp CD11c som en markør for å identifisere mus DC er gyldig, som i milten, der de fleste CD11c + celler representere CDC undergruppe som uttrykker høye nivåer av de store histocompatibility komplekse klasse II (MHC-II). Imidlertid er lunge et mer heterogent vev der væreside DC undergrupper, det er en høy prosentandel av en tydelig celle befolkning som uttrykker høye nivåer av CD11c bout lave nivåer av MHC-II. Basert på karakterisering sin og det meste på sin uttrykk av F4/80, en milten macrophage markør har CD11c hi MHC-II lo lunge celle befolkningen blitt identifisert som lunge makrofager 10 og mer nylig, som en potensiell DC forløper 11.
I motsetning til mus PDC, har studiet av den spesifikke rolle CDC i lungene immunresponsen vært begrenset på grunn av mangel på en bestemt markør som kan hjelpe i isolering av disse cellene. Derfor, i dette arbeidet, beskriver vi en prosedyre for å isolere svært renset mus lunge CDC. Isolering av pulmonale DC undergrupper representerer et meget nyttig verktøy for å få innsikt inn i funksjonen av disse cellene som svar på respiratoriske patogener samt miljøfaktorer som kan utløse vertens immunrespons i lungene.
Protocol
Discussion
Isolering av lunge mus DC er en viktig teknikk for studiet av et bredt spekter av luftveiene stimuli. Prosessen med å innhente disse cellene inkluderer kritiske trinnene som forhindrer tap av celler samt celleviabilitet og renhet. Perfusing lungene før samlingen vil bidra til å eliminere eventuelle perifere celler samt redusere forurensning erytrocytter. Bruk av automatiserte dissosiasjon kan advanteogus når et stort antall lungene blir håndtert, ellers kan du melde deg for alternativ protokollen, husk at spredning…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke for Marilyn Dietrich på LSU flowcytometrisystemer kjerner Facility for hennes hjelp med celle sortering og Peter Mottram for hans hjelp med microphotographs. Dette arbeidet ble finansiert av Flight Attendant Medical Research Institute, LSU-Competitive Research Program Award, og NIH / NIAID Grants P20 RR020159 og R03AI081171.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Pharmingen | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD-Pharmingen | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Falcon | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Falcon | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltentyi | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD |
Riferimenti
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
