Una preparazione altamente purificato di cellule dendritiche del polmone del mouse è descritto. Particolare enfasi è data l'isolamento delle tradizionali sottoinsieme delle cellule dendritiche.
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Articolo metodologico
Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule dendritiche del polmone (DC) svolgono un ruolo fondamentale nel rilevamento invadendo 1,2 patogeni così come nel controllo della risposta tollerogeniche 3 nel tratto respiratorio. Almeno tre principali sottoinsiemi di cellule dendritiche del polmone sono stati descritti nei topi: convenzionale DC (CDC) 4, plasmacitoidi DC (PDC) 5 e la produzione di IFN-DC assassino (IKDC) 6,7. Il sottoinsieme CDC è il sottoinsieme DC più importanti nel polmone 8.
Il marcatore comune noto per identificare sottoinsiemi DC è CD11c, un tipo mi transmembrana integrina (β2), che si esprime anche sui monociti, macrofagi, neutrofili e alcune cellule B 9. In alcuni tessuti, utilizzando CD11c come marcatore per identificare il mouse DC è valido, come nella milza, dove la maggior parte delle cellule + CD11c rappresentano il sottoinsieme CDC che esprime alti livelli del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (MHC-II). Tuttavia, il polmone è un tessuto più eterogeneo dove esseresottoinsiemi lato DC, vi è un'alta percentuale di una popolazione di cellule distinte che esprime alti livelli di CD11c attacco bassi livelli di MHC-II. Sulla base della sua caratterizzazione e soprattutto sulla sua espressione di F4/80, un marcatore dei macrofagi della milza, il CD11c hi-MHC II popolazione di cellule del polmone lo è stato identificato come i macrofagi polmonari 10 e più recentemente, come un potenziale precursore DC 11.
In contrasto con il mouse pDC, lo studio del ruolo specifico del CDC nella risposta immunitaria polmonare è stata limitata a causa della mancanza di un marcatore specifico che potrebbe aiutare a l'isolamento di queste cellule. Pertanto, in questo lavoro, si descrive una procedura per isolare altamente purificato del mouse polmone CDC. L'isolamento di polmonare sottoinsiemi DC rappresenta uno strumento molto utile per acquisire conoscenze in funzione di queste cellule in risposta a patogeni respiratori così come i fattori ambientali che possono innescare la risposta immunitaria nei polmoni.
Protocollo
1. Perfusione polmonare e sospensione singola cellula
- Euthanize il mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina / xylazina miscela anestetico (in mg / mouse ketamina 1,8, xilazina 0,19) e dissanguamento attraverso la vena femorale
- Esporre la cavità toracica da taglio e delicatamente tirando indietro la pelle esterna del peritoneo. Procedere per aprire il diaframma tagliando la gabbia toracica per esporre sia il cuore ei polmoni.
- Profumato delicatamente i polmoni usando una siringa da 5 ml riempito con EDTA-HBSS (1 mM EDTA di calcio / magnesio senza HBSS). Collegare un 25 ago G e inserire l'ago nel ventricolo destro. Per e....
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Discussione
Isolamento dei polmonare topo DC è una tecnica importante per lo studio di una vasta gamma di stimoli respiratori. Il processo per ottenere queste cellule include passaggi critici che impediscono la perdita di cellule così come la vitalità cellulare e la purezza. Perfusione del polmone prima della raccolta contribuirà a eliminare eventuali cellule periferiche e ridurre eritrociti contaminante. L'utilizzo della dissociazione automatico può essere advanteogus quando un gran numero di polmoni vengono gestiti, altriment.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare per Marilyn Dietrich presso l'impianto di core LSU Citometria a flusso per il suo aiuto con la separazione delle cellule e Peter Mottram per la sua assistenza con il microfotografie. Questo lavoro è stato finanziato dal Assistente di volo Medical Research Institute, l'LSU-competitivi Premio programma di ricerca, e il NIH / NIAID Borse P20 RR020159 e R03AI081171.
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Materiali
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Lisi buffer di ACK | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-topo CD11c (HL3) | BD Pharmingen | 5580979 | PE-Cy7 coniugato |
| Anti-topo IA / IE (269) | BD-Pharmingen | 553623 | Coniugato con FITC |
| Collangenase tipo 1A | Sigma | 9891-500mg | |
| Cellula filtri | BD Falcon | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) microsfere | Miltenyi | 130-052-001 | |
| DNasi I | Sigma | D5025-150KU | |
| Sale di Hank soluzione equilibrata | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes soluzione tampone | Invitrogen | 15630 | |
| Piastre di Petri 60 millimetri | BD Falcon | 351016 | |
| GentleMACS ™ C tubi | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociatore | Miltentyi | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro ™ | Miltenyi | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD |
Riferimenti
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Manicassamy, S., Pulendran, B.
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Ristampe e permessi
