הביטוי ניתוח Linker-היסטון תת סוגים יונקים
Summary
אנו מתארים סדרה של מבחני לנתח את רמות הביטוי של ההיסטונים מקשר H1. ה-mRNA של גנים בודדים H1 נמדדים באופן כמותי על ידי שעתוק אקראי מבוסס הפוך פריימר ואחריו בזמן אמת PCR, ואילו חלבון כימות של ההיסטונים H1 מושגת על ידי ניתוח HPLC.
Abstract
היסטון H1 מקשר נקשר החלקיקים ליבת הנוקלאוזום ו-DNA מקשר, בהנחיית מתקפל של הכרומטין למבנה מסדר גבוה יותר. H1 הוא חיוני להתפתחות היונקים 1 ומווסת ביטוי גנים ספציפיים in vivo 2-4. בין חלבונים היסטון השמורים באבולוציה, משפחת ההיסטונים H1 מקשר הוא קבוצה הטרוגנית ביותר. ישנם 11 תת H1 ביונקים אשר מוסדר באופן דיפרנציאלי במהלך הפיתוח בסוגי תאים שונים. אלה כוללים תת H1 5 סומטי H1s (H1a אלקטרוני), H1 החלפת 0, 4 תאים נבט תת ספציפיים H1, ואת H1x 5. נוכחות של מספר רב של תת H1 שונים בזיקה DNA מחייב יכולת הדחיסה הכרומטין 6-9 מספק רמה נוספת של אפנון של תפקוד הכרומטין. לכן, ניתוח ביטוי כמותי של תת H1 בודדים, הן של ה-mRNA וחלבונים, יש צורך להבין טוב יותר את הרגולציה של גבוההכרומטין מנת מבנה ותפקוד.
כאן אנו מתארים סדרה של מבחני המיועדים לניתוח רמות הביטוי של תת H1 בודדים (איור 1). ביטוי mRNA של גנים שונים H1 חלופה נמדדת על ידי מערכת של רגישות גבוהה וכמותית שעתוק-PCR (qRT-PCR) מבחני הפוכה, אשר מהיר יותר, מדויק יותר ודורשים דגימות הרבה פחות לעומת הגישה החלופית של ניתוח כתם הצפון. שלא כמו רוב הודעות ה-mRNA אחרים הסלולר, mRNAs עבור גנים היסטון ביותר, כולל רוב הגנים H1, חסר זנב ארוך פולה, אבל מכילים מבנה גזע לולאה על האזור מתורגמת '3 (UTR) 10. לכן, cDNAs מוכנים מ-RNA הכל על ידי שעתוק לאחור באמצעות פריימרים אקראיים במקום oligo-DT primers. זמן אמת מבחני ה-PCR עם פריימרים ספציפיים כל תת H1 (טבלה 1) מבוצעות כדי להשיג מדידה כמותית מאוד של רמות ה-mRNA של תת H1 הפרטs. הביטוי של גנים משק מנותחים כפקדי עבור נורמליזציה.
השפע היחסי של החלבונים של כל תת H1 ו ההיסטונים הליבה מתקבל דרך הפוכה כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלי שלב (RP-HPLC) ניתוח של ההיסטונים הכל המופקים בתאי יונקים 11-13. שיטת HPLC ותנאי elution המתואר כאן נותנים הפרדות אופטימלי של תת H1 עכבר. על ידי לכימות פרופיל HPLC, אנו מחשבים את חלקם היחסי של תת H1 הפרט בתוך המשפחה H1, כמו גם לקבוע את H1 יחס הנוקלאוזום בתאים.
Protocol
Discussion
קבוצה של מבחני שהוצג לאפשר ניתוח מקיף של רמות הביטוי של יונקים תת היסטון מקשר. מתוכנן כראוי qRT-PCR מבחני לספק מדידות רגישות גבוהה ומדויקת של הודעות רנ"א של כל הגנים יונקים היסטון H1. חלק חשוב של qRT-PCR מבחני עבור מקשר גנים תת היסטון הוא הכנת cDNA באמצעות צבע יסוד על בסיס אקר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק GM085261 ואת הקואליציה סרטן גאורגיה פרס נכבדים Scholar (כדי YF).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | AMP-D1 |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 |
| Microseal ‘B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 |
| Sucrose | Agros Organics | AC40594 |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Applied Science | 11836153001 |
| EDTA | Sigma | E-5134 |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR | VW3648-3 |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Agros Organics | AC42330 |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J.T.Baker | 9470-01 |
Riferimenti
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochimica. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th’ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
