ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו
Summary
שיטה זו מאפשרת ניטור של תאים בזמן אמת מדידות כמותיות של פרמטרים שונים הגירה סלולריים כגון מהירות, תזוזה, ומהירות. שלא כמו שיטות מסורתיות, גישה זו בזמן אמת אינה מבוססת על מדידות כמותיות נקודות קצה הגירה, אלא היא מאפשרת ניטור חישוב פרמטרים שונים ברציפות.
Abstract
נדידת תאים היא תהליך דינמי, וזה חשוב עבור ההתפתחות העוברית, תיקון רקמות, בתפקוד המערכת החיסונית, וכן הפלישה הגידול 1, 2. במהלך הנדידה כיוונית, התאים לנוע במהירות בתגובה האות chemotactic תאיים, או כתגובה לאותות פנימיים הניתנים על ידי 3 מכונות תנועתיות בסיסי. הגירה אקראית מתרחשת כאשר תא בעל כיווניות פנימי נמוך, מה שמאפשר לתאים לחקור את הסביבה המקומית שלהם.
נדידת תאים היא תהליך מורכב, בתא התגובה הראשונית עובר קיטוב ומרחיב בליטות לכיוון ההגירה 2. השיטות המסורתיות למדידת הגירה כגון assay הגירה בוידן קאמרית היא שיטה קלה למדידת chemotaxis במבחנה, המאפשרת מדידת הגירה כתוצאה נקודת הסיום. עם זאת, גישה זו לא מאפשרת מדידה של פרמטרים הגירה בודדים, וגם לא מאפשרים visualization של שינויים מורפולוגיים כי התא עובר במהלך ההעברה.
כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת לנו לעקוב אחר תאים נודדים בזמן אמת באמצעות וידאו – פקיעה מיקרוסקופיה זמן. מאז נדידת תאים ופלישה הם סימני ההיכר של סרטן, שיטה זו יחולו בחקר תאים סרטניים הגירה הפלישה במבחנה. הגירה אקראי של טסיות כבר נחשב לאחד הפרמטרים של 4 תפקוד טסיות, ולכן שיטה זו יכולה גם לעזור בלימוד פונקציות הטסיות. Assay זה יש את היתרון של להיות מהיר, אמין, לשחזור, ואינו דורש אופטימיזציה של מספרים סלולריים. כדי לשמור על תנאים מתאימים פיזיולוגית של תאים, מיקרוסקופ מצויד אספקת 2 CO ו התרמוסטט לטמפרטורה. תנועת התא מנוטר על ידי צילום תמונות באמצעות המצלמה מצויד המיקרוסקופ במרווחי זמן קבועים. נדידת תאים ניתן לחשב את המהירות הממוצעת על ידי מדידהעקירה שות ל מוצע נפ, המחושב על ידי תוכנה Slidebook.
Protocol
Discussion
בזמן אמת אקראי assay הגירה מאפשרת מדויק, ניתוח רגישות, של הגירה פרמטרים סלולריים כגון מהירות תזוזה. שיטה זו אינה מצטמצמת אך בסופו של דבר המדידה ערך הנקודה, ולכן הוא כמותי יותר. מאז, תאים מנוטרים במדיום DMEM רגיל עם סרום, זה מפחית את ההשפעה המזיקה של הדגירה כבר תקשורת חופשית …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות אמנדה Struckhoff לעזרה ראשונית עם הניסוי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות 5RO1CA115706.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio- Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
Riferimenti
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
- Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
- Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
- Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
- Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
- Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
- Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
- Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).
