Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)
Summary
Multiple-bersaglio tracciatura è un algoritmo casalingo sviluppato per il monitoraggio singolarmente molecole marcate nella membrana plasmatica di cellule viventi. In modo efficiente la rilevazione, la stima e la rintracciabilità nel tempo molecole ad alta densità fornire una user-friendly, strumento completo per studiare la dinamica della membrana su scala nanometrica.
Abstract
Il nostro obiettivo è quello di ottenere una descrizione completa dei processi molecolari che si verificano a membrane cellulari in diverse funzioni biologiche. Il nostro obiettivo è di caratterizzare la complessa organizzazione e le dinamiche della membrana plasmatica a livello di singola molecola, mediante lo sviluppo di strumenti analitici dedicati al Single-Particle Tracking (SPT) ad alta densità: Multipli-Target Tracing (MTT) 1. Singola molecola videomicroscopia, offrendo millisecondo e la risoluzione nanometrica 1-11, consente una rappresentazione dettagliata di organizzazione della membrana 12-14 mappare con precisione da descrittori quali la localizzazione delle cellule recettori, la mobilità, parto o interazioni.
Abbiamo rivisitato SPT, sia sperimentalmente che algoritmicamente. Aspetti sperimentali incluso ottimizzare la configurazione e l'etichettatura delle cellule, con particolare attenzione al raggiungimento della densità di etichettatura più alto possibile, al fine di fornire una fotografia dinamica di dinamica molecolare unos avviene all'interno della membrana. Problemi algoritmici in questione ogni passo utilizzare per la ricostruzione delle traiettorie: picchi di rilevazione, la stima e la riconnessione, affrontato da specifici strumenti di analisi delle immagini 15,16. Implementazione deflazione dopo che il rilevamento consente picchi di salvataggio inizialmente nascosta da vicini, i picchi più forti. Da notare, migliorando il rilevamento influisce direttamente riconnessione, la riduzione delle lacune all'interno di traiettorie. Le prestazioni sono state valutate con simulazioni Monte-Carlo per la densità e l'etichettatura diversi valori di rumorosità, che in genere rappresentano i due principali limiti per le misure parallele ad alta risoluzione spazio-temporale.
La precisione nanometrica 17 ottenuta per singole molecole, utilizzando successive on / off o photoswitching ottica non lineare, in grado di fornire osservazioni esaustive. Questa è la base di metodi nanoscopia 17 come STORM 18, PALM 19,20, RESOLFT 21 o STED 22,23, which possono spesso richiedere campioni di immagini fisse. Il compito centrale è l'individuazione e la stima dei picchi di diffrazione limitata provenienti dalle singole molecole. Quindi, fornendo adeguati presupposti, quali la gestione di un costante precisione di posizione invece del moto browniano, MTT è semplicemente adatto per le analisi nanoscopica. Inoltre, MTT possono fondamentalmente essere utilizzato in qualsiasi scala: non solo per le molecole, ma anche per cellule o animali, per esempio. Quindi, MTT è un algoritmo di rilevamento potente che trova applicazioni su scala molecolare e cellulare.
Protocol
Discussion
In una singola particella di monitoraggio, oltre agli aspetti cellulari e microscopia, l'analisi rappresenta una parte sostanziale del lavoro. Questo risolve l'algoritmo utilizzato per eseguire le tre compiti principali: rilevazione, stima e ricollegando i picchi su ogni frame. Ma l'aspetto conseguente di questo lavoro risiede nell'elaborazione lo stesso algoritmo, che potrebbe essere necessario essere adattato per qualsiasi nuova inchiesta dedicata, essenzialmente per gli ultimi, i passaggi aggiuntivi (…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del nostro team, in particolare Blache MC per l'assistenza tecnica, nonché M Irla e B Imhof, per il sostegno e proficue discussioni. I dati relativi deflazione e il confinamento riprodotto per gentile concessione di Nature Methods. Questo progetto è sostenuto da finanziamenti istituzionali del CNRS, l'INSERM e Marsiglia University, e da contributi specifici della Regione Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 blan 1214 01) & Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR è supportato da una borsa di studio per il Cancro Ligue Nationale Contre le.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Quantity |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | NUNC | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO | 15630 | 250 μl |
| Equipment | Company | Reference |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000U |
| Fluorescent lamp | Nikon | Intensilight C-HGFIE |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon | Plan Fluor 1.30 |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon | APO TIRF 1.49 |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box |
Appendix: example Script of MTT supplementary analysis
function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities
if nargin<1 % no file_name provided?
files = dir(‘*.stk’);
if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
file_name = files(1).name; % default: first stk file
disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end
file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file
%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3
% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …
% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);
tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);
%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums
for itrc = 1:N_traces
No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end
%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)
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