Multiple-Target-Tracing ist ein Algorithmus für die Verfolgung von hausgemachten individuell markierten Moleküle in der Plasmamembran von lebenden Zellen entwickelt. Effiziente Erfassung, Abschätzung und Tracing-Moleküle im Laufe der Zeit bei hoher Dichte bieten eine benutzerfreundliche, umfassende Werkzeug, um nanoskalige Membran Dynamik zu untersuchen.
Unser Ziel ist eine umfassende Beschreibung der molekularen Vorgänge bei zellulären Membranen in verschiedenen biologischen Funktionen zu erhalten. Unser Ziel ist die Charakterisierung der komplexen Organisation und Dynamik der Plasmamembran auf Einzel-Molekül-Ebene, durch die Entwicklung von Analysewerkzeugen gewidmet Single-Particle Tracking (SPT) in hoher Dichte: Multiple-Target Tracing (MTT) 1. Einzel-Molekül-Videomikroskopie und bietet Millisekunde und Auflösung im Nanometerbereich 1-11, erlaubt eine detaillierte Darstellung der Membran Organisation von 12-14 genau Mapping-Deskriptoren wie Zell-Rezeptoren-Lokalisierung, Mobilität, Gefangenschaft oder Wechselwirkungen.
Wir revisited SPT, sowohl experimentell als auch algorithmisch. Experimentelle Aspekte waren die Optimierung Setup-und Zell-Kennzeichnung, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Erreichen der höchstmöglichen Dichte Kennzeichnung, um eine dynamische Momentaufnahme der Molekulardynamik einen gebens tritt es innerhalb der Membran. Algorithmische Fragen betroffenen einzelnen Schritte für den Wiederaufbau von Flugbahnen verwendet: Spitzen-Erkennung, Einschätzung und der Wiederanschluss von speziellen Werkzeugen aus Bildanalyse 15,16 gerichtet. Implementieren von Deflation nach Entdeckung ermöglicht Rettung Gipfel zunächst von benachbarten, stärkeren Peaks versteckt. Zu beachten ist, wirkt sich direkt auf die Verbesserung der Erkennung Wiederverbindung, durch Reduzierung der Lücken innerhalb Flugbahnen. Vorstellungen wurden ausgewertet mit Hilfe von Monte-Carlo-Simulationen für unterschiedliche Kennzeichnung Dichte und Noise-Werte, die in der Regel stellen die beiden wesentlichen Einschränkungen für parallele Messungen bei hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung.
Die Nanometergenauigkeit 17 für einzelne Moleküle erhalten, unter Verwendung von entweder aufeinanderfolgenden Ein / Aus Photoschalten oder der nichtlinearen Optik, liefern kann, flächendeckende Betrachtungen. Dies ist die Grundlage von Nanoskopiemethoden 17 wie Sturm 18, PALM 19,20, 21 oder RESOLFT STED 22,23, which erfordert häufig den Imaging-fixierten Proben. Die zentrale Aufgabe ist die Erkennung und Einschätzung der beugungsbegrenzten Spitzen ausgehend von Single-Moleküle. Daher angemessene Annahmen wie z. B. Umgang mit einer konstanten Positionsgenauigkeit anstelle der Brownschen Bewegung, wird MTT unkompliziert für nanoskopische Analysen geeignet. Ferner kann MTT grundsätzlich in jedem Maßstab verwendet werden: nicht nur für Moleküle, sondern auch für Zellen oder Tiere, zum Beispiel. Daher ist ein leistungsfähiges MTT-Tracking-Algorithmus, der Anwendungen findet auf molekularer und zellulärer Skalen.
In Einzelpartikel-Tracking, neben den Zellen und Mikroskopie Aspekte stellt die Analyse einen wesentlichen Teil der Arbeit. Diese befasst sich mit der Algorithmus verwendet, um die drei wichtigsten Aufgaben: Erkennen, Abschätzen und wieder Gipfeln über jeden Frame. Aber die konsequente Aspekt dieser Arbeit besteht in der Erarbeitung des Algorithmus selbst, die müssen für jede neue dedizierte Untersuchung, im Wesentlichen für den letzten, zusätzliche Schritte (wie Entschlüsselung Arten der Bewegung, Interaktionen …
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns bei Mitgliedern unseres Teams, vor allem MC Blache für technische Unterstützung, sowie M-und B-Irla Imhof, für ihre Unterstützung und fruchtbare Diskussionen. Zahlen für Deflation und Entbindung reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Nature Methods. Dieses Projekt wird von institutionellen Zuschüssen aus dem CNRS, INSERM und Marseille-Universität, und durch gezielte Zuschüsse aus der Region Provence-Alpes-Côte d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR unterstützt-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 BLAN 1214 01) und der Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR wird durch ein Stipendium der Ligue Nationale Contre le Cancer unterstützt.
Reagent | Company | Catalogue number | Quantity |
Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
HBSS without Ca2+ | GIBCO | 14175 | 1 ml |
0.05% Trypsin EDTA | GIBCO | 25300 | 1 ml |
8-well Lab-tek | NUNC | 155441 | 1 |
QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21435 | 18.5 μg |
Complete medium | |||
DMEM | GIBCO | 41965 | 500 ml |
Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | 50 ml |
L-Glutamine | GIBCO | 25030 | 5 ml |
HEPES | GIBCO | 15630 | 5 ml |
Sodium Pyruvate | GIBCO | 11360 | 5 ml |
Imaging medium | |||
HBSS with Ca2+ | GIBCO | 14025 | 25 ml |
HEPES | GIBCO | 15630 | 250 μl |
Equipment | Company | Reference |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000U |
Fluorescent lamp | Nikon | Intensilight C-HGFIE |
1.3 NA 100x objective | Nikon | Plan Fluor 1.30 |
1.49 NA 100x objective | Nikon | APO TIRF 1.49 |
Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B |
Thermostated box | Life Imaging Services | The Box |
Appendix: example Script of MTT supplementary analysis
function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities
if nargin<1 % no file_name provided?
files = dir(‘*.stk’);
if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
file_name = files(1).name; % default: first stk file
disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end
file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file
%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3
% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …
% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);
tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);
%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums
for itrc = 1:N_traces
No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end
%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)