Die Anwendung des MassSQUIRM für quantitative Messungen von Lysin-Demethylase
Summary
Wir stellen eine Methode für die Verwendung von MALDI-Massenspektrometrie und reduktive Methylierung Chemie auf Veränderungen in Lysinmethylierung quantifizieren.
Abstract
In jüngster Zeit haben epigenetische Regulatoren als wichtige Akteure in vielen verschiedenen Krankheiten 3.1 entdeckt worden. Als ein Ergebnis sind diese Enzyme Hauptziele für kleine Moleküle Studien und Entwicklung von Arzneimitteln 4. Viele epigenetische Regulatoren haben erst vor kurzem entdeckt und sind noch im Gange klassifiziert. Unter diesen Enzymen sind Lysin Demethylasen die Methylgruppen von Lysine an Histonen und andere Proteine zu entfernen. Durch die neuartige Charakter dieser Klasse von Enzymen, haben einige Tests entwickelt worden, um ihre Aktivität zu studieren. Dies war eine Straßensperre sowohl die Einstufung und hohem Durchsatz Studie Histondemethylasen. Derzeit existieren nur sehr wenige Demethylase Assays. Diejenigen, die es gibt, sind in der Regel in der Natur qualitativen und können nicht gleichzeitig zwischen den verschiedenen Lysin Methylierungszustände zu erkennen (un-, mono-, di und tri-). Die Massenspektrometrie wird häufig verwendet, um Demethylase-Aktivität zu bestimmen, aber die aktuellen massenspektrometrischen Assays tunnicht ansprechen, ob differentiell methylierte Peptide anders zu ionisieren. Differential-Ionisation von Peptiden methylierte macht den Vergleich Methylierung Staaten schwierig und schon gar nicht quantitativ (Abbildung 1A). So verfügbaren Assays sind nicht für die umfassende Analyse der Demethylase optimiert.
Hier beschreiben wir ein Verfahren genannt MassSQUIRM (massenspektrometrische Quantifizierung unter Verwendung Isotopen reduktive Methylierung), die auf der reduktiven Methylierung Amingruppen mit deuteriertem Formaldehyd zu erzwingen, Lysine sein di-methylierten basiert, sodass sie im wesentlichen die gleichen chemischen Spezies und daher ionisieren gleichen (Abbildung 1B). Die einzige chemische Unterschied nach der reduktiven Methylierung ist Wasserstoff und Deuterium, die keinen Einfluss auf MALDI-Ionisierung Wirkungsgrade. Die MassSQUIRM Nachweis ist spezifisch für Demethylase Reaktionsprodukte mit un-, mono-oder di-methylierte Lysine. Der Assay ist auch anwendbar auf Lysin-Methyltransferasen geben die saIch Reaktionsprodukte. Wir verwenden hier eine Kombination aus der reduktiven Methylierung Chemie und MALDI-Massenspektrometrie, um die Aktivität von LSD 1 zu messen, eine Lysin-Demethylase entfernen kann di-und mono-Methylgruppen, einem synthetischen Peptid Substrat 5. Dieser Assay ist einfach und leicht zugänglich einem der Labor mit Zugang zu einem MALDI-Massenspektrometer im Labor oder durch eine Proteomik-Anlage. Der Test hat ~ 8-fach dynamischen Bereich und ist leicht skalierbar, um Platten-Format 5.
Protocol
Discussion
MassSQUIRM ist eine preisgünstige und quantitative Methode zur umfassenden Analyse der Aktivität von Lysin Demethylasen in Mono-und Di-Methylierung beteiligt. MassSQUIRM bietet nicht nur die Quantifizierung des Produkts der Reaktion, sondern auch für die Zwischenprodukte. Dieser Test kann als ein mächtiges Werkzeug bei der Untersuchung des Mechanismus von LSD 1 und andere Histondemethylasen verwendet werden. Es sind auch nützlich für die Klassifizierung wie die neu entdeckten Lysin Demethylase Enzyme wie PHF8 und …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der UAMS Proteomics-Fazilität für die massenspektrometrische Unterstützung. Finanzierung für dieses Projekt wurde durch die NIH Zuschüsse P20RR015569, P20RR016460 und R01DA025755 zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 |
| H3K4me2-biotin peptide | prepared in-house | none |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 |
| C18 ZipTip | Millipore | ZTC18M |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| acetonitrile | Fisher | A996 |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma | 85707 |
| Borane dimethylamine | Sigma | 180238 |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 |
| Tris | Fisher | BP154 |
| KCl | Fisher | BP366 |
| MgCl2 | Fisher | BP214 |
| Glycerol | Fisher | G33 |
| Formic acid | Fluka | 06440 |
| Methanol | Fisher | A452 |
| Na-phosphate | Fisher | BP329 |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmerSciex | none |
Riferimenti
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