라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용
Summary
우리는 라이신 methylation의 변화를 계량하는 데 든 질량 분광법과 reductive methylation 화학을 사용하는 방법을 제시한다.
Abstract
최근 epigenetic 규제는 1-3 여러 가지 질병의 주요 선수로 발견되었습니다. 결과적으로 이러한 효소는 작은 분자 연구 및 약물 개발 4 주요 목표입니다. 많은 epigenetic 규제는 최근에 발견하고 분류하는 과정이 아직 없습니다. 이들 효소 중 histones 및 다른 단백질에 lysines에서 메틸 그룹을 제거 라이신 demethylases 있습니다. 효소의이 클래스의 소설 특성으로 인해 몇 assays들은 활동을 공부하기 위해 개발되었습니다. 이 분류와 히스톤 demethylases의 높은 처리량 연구 양쪽에 도로를 차단했습니다. 현재 거의 demethylase의 assays가 존재합니다. 존재하지 그것들은 자연에서 질적 경향 동시에 다른 라이신 methylation 상태 사이에 분별없는 수 있습니다 (취소, 모노 -, 디 – 및 트라이 -). 질량 분석법은 일반적으로 demethylase 활동을 결정하는 데 사용하지만 현재 대량 spectrometric assays 할있다differentially methylated 펩티드 다르게 이온화 여부를 해결할 수 없습니다. methylated 펩티드의 차동 이온화는 methylation 상태가 어렵고 (그림 1A) 확실히 양적되지 비교 있습니다. 따라서 가능한 assays는 demethylase 활동의 포괄적인 분석을 위해 최적화되지 않습니다.
여기 따라서 본질적으로 동일한 화학 종족들을 만들고, 모든 lysines는 디 – methylated로 강제로 진정제를 맞았을 포름 알데히드와 아민 그룹의 reductive methylation을 기반으로 MassSQUIRM라는 방법을 (isotopic reductive methylation을 사용하여 질량 spectrometric quantitation) 설명하고 있으므로이 이온화 동일한 (그림 1B). reductive methylation에 따라 유일한 화학 변화는 수소와 든 이온화 효율에 영향을주지 않습니다 중수소입니다. MassSQUIRM 분석이 해제, 모노 또는 디 – methylated lysines와 demethylase 반응 제품에 대한 구체적인 것입니다. 분석은 또한 SA주는 라이신 methyltransferases에 적용나에게 반응 제품보기. 여기서는 reductive methylation 화학 및 든 질량 분광법 LSD1의 활동을 측정, 합성 펩티드 기질 5, 디 – 및 모노 – 메틸 그룹을 제거하는 능력이 라이신 demethylase.의 조합을 사용 이 분석은 간단하고 실험실이나 proteomics 시설을 통해 든 질량 분석기에 대한 액세스 권한이있는 모든 실험실로 쉽게받을 수있는 것입니다. 검정은 ~ 8 배 다이나믹 레인지를 가지고 있으며, 플레이트 형식 5 ~ 쉽게 확장 가능합니다.
Protocol
Discussion
MassSQUIRM은 모노와 DI-methylation에 관여 라이신 demethylases의 활동의 종합적인 분석을위한 저렴하고 양적 방법입니다. MassSQUIRM는 반응의 제품뿐만 아니라 중간체를위한뿐만 아니라 quantitation를 제공합니다. 이 분석은 LSD1 및 기타 히스톤 demethylases의 메커니즘을 연구의 강력한 도구로 사용될 수 있습니다. 그것은 또한 PHF8 많은 새로 발견된 라이신 demethylase 효소를 분류하고 특정 methyltransferase 효소에 사…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 대량 spectrometric 지원 UAMS의 Proteomics 시설 감사드립니다. 이 프로젝트에 대한 자금 지원은 NIH 보조금 P20RR015569, P20RR016460 및 R01DA025755에 의해 제공되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 |
| H3K4me2-biotin peptide | prepared in-house | none |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 |
| C18 ZipTip | Millipore | ZTC18M |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| acetonitrile | Fisher | A996 |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma | 85707 |
| Borane dimethylamine | Sigma | 180238 |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 |
| Tris | Fisher | BP154 |
| KCl | Fisher | BP366 |
| MgCl2 | Fisher | BP214 |
| Glycerol | Fisher | G33 |
| Formic acid | Fluka | 06440 |
| Methanol | Fisher | A452 |
| Na-phosphate | Fisher | BP329 |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmerSciex | none |
Riferimenti
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