Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina
Summary
Apresentamos um método para o uso de espectrometria de massa MALDI e química metilação redutiva para quantificar as mudanças na metilação da lisina.
Abstract
Recentemente, os reguladores epigenéticos têm sido descobertos como atores-chave em muitos diferentes doenças 1-3. Como resultado, estas enzimas são alvos principais para os estudos de moléculas pequenas e 4 desenvolvimento de drogas. Muitos reguladores epigenéticos têm apenas recentemente descobertos e ainda estão em vias de ser classificado. Entre estas enzimas são demethylases lisina que removem grupos metilo a partir de lisinas na histonas e outras proteínas. Devido à natureza novo desta classe de enzimas, ensaios de poucos têm sido desenvolvidos para estudar a sua actividade. Este tem sido um bloqueio na estrada para tanto a classificação e estudo de alto rendimento de demethylases histonas. Atualmente, ensaios demetilase existem poucos. As que existem tendem a ser de natureza qualitativa e não pode discernir entre simultaneamente os diferentes estados de metilação de lisina (un-, mono-, di-e tri-). Espectrometria de massa é comumente usado para determinar a atividade demetilase mas atuais ensaios de espectrometria de massa donão dirigir se peptídeos diferencialmente metilados ionizar de forma diferente. Ionização diferencial de péptidos metilados faz comparando estados de metilação difícil e certamente não quantitativa (Figura 1A). Assim, os ensaios disponíveis não são otimizados para a análise global da atividade demetilase.
Descrevemos aqui um método chamado MassSQUIRM (quantificação por espectrometria de massa utilizando metilação redutiva isotópica) que é baseado em metilação redutiva de grupos amina com formaldeído deuterado para forçar todos os lisinas ser di-metilado, tornando-as assim essencialmente os mesmos espécies químicas e, portanto, ionizar o mesmo (Figura 1B). A diferença química apenas após a metilação redutiva é hidrogénio e deutério, que não afecta a eficiência de ionização MALDI. O ensaio MassSQUIRM é específico para produtos de reacção desmetilase com lisinas un-, mono-ou di-metilados. O ensaio é também aplicável a metiltransferases lisina dando o same produtos de reacção. Aqui, nós usar uma combinação de química metilação redutiva e espectrometria de massa MALDI para medir a actividade de LSD1, um desmetilase lisina capaz de remover di-e mono-metilo grupos, sobre um substrato de péptido sintético 5. Este ensaio é simples e facilmente acessíveis a qualquer laboratório com acesso a um espectrómetro de massa MALDI em laboratório ou através de um mecanismo proteômica. O ensaio tem ~ gama de 8 vezes dinâmico e é prontamente adaptar ao formato de placa 5.
Protocol
Discussion
MassSQUIRM é um método barato e quantitativa para análise abrangente da atividade de demethylases lisina envolvidas na mono-e di-metilação. MassSQUIRM oferece não só a quantificação do produto da reacção, mas também para os intermediários. Este ensaio pode ser utilizado como uma ferramenta poderosa para estudar o mecanismo de LSD1 e outros demethylases histona. Também irá ser útil para a classificação de muitas enzimas recém-descobertas desmetilase de lisina, tais como PHF8 e poderiam ser usados ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao UAMS Facilidade Proteomics de apoio por espectrometria de massa. O financiamento para este projeto foi fornecido pelo NIH concede P20RR015569, P20RR016460 e R01DA025755.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 |
| H3K4me2-biotin peptide | prepared in-house | none |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 |
| C18 ZipTip | Millipore | ZTC18M |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| acetonitrile | Fisher | A996 |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma | 85707 |
| Borane dimethylamine | Sigma | 180238 |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 |
| Tris | Fisher | BP154 |
| KCl | Fisher | BP366 |
| MgCl2 | Fisher | BP214 |
| Glycerol | Fisher | G33 |
| Formic acid | Fluka | 06440 |
| Methanol | Fisher | A452 |
| Na-phosphate | Fisher | BP329 |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmerSciex | none |
Riferimenti
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