In questo rapporto si descrive un metodo per schiacciare nervo sciatico mouse. Questo metodo utilizza pinze emostatiche immediatamente disponibili e facilmente riproducibile e produce completo schiacciamento del nervo sciatico. Inoltre, si descrive un metodo per preparare supporti muscolo intero adatti per l'analisi di rigenerazione nervosa dopo schiacciamento del nervo sciatico.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte
In questo articolo
Sommario
Abstract
Rigenerazione del sistema nervoso periferico (SNP) è ampiamente studiata sia per la sua rilevanza per le malattie umane e comprendere la robusta risposta rigenerativa montato dai neuroni PNS così eventualmente illuminano i fallimenti di rigenerazione CNS 1. Schiacciamento del nervo sciatico (assonotmesi) è uno dei modelli più comuni di lesioni dei nervi periferici nei roditori 2. Frantumazione interrompe tutti gli assoni delle cellule di Schwann, ma lamine basali sono conservati in modo che la rigenerazione è ottimale 3,4. Ciò consente al ricercatore di studiare proprio la capacità di un assone di interagire sia con il cellule di Schwann e lamine basale 4. I ratti sono stati generalmente i modelli animali preferiti per schiacciamento del nervo sperimentale. Essi sono ampiamente disponibili e la loro nervo sciatico lesionato fornisce una ragionevole approssimazione delle lesioni nervose umane 5,4. Anche se di dimensioni inferiori rispetto ratto del nervo, il nervo mouse è dotato di molte qualità simili. Ma, soprattutto, mousmodelli E sono sempre più prezioso per l'ampia disponibilità di linee transgeniche permette ora una dissezione dettagliata delle singole molecole fondamentali per la rigenerazione del nervo 6, 7. Precedenti ricercatori hanno usato diversi metodi per produrre uno schiacciamento del nervo o lesioni anche semplici pinzette angolate, pinze fredde, pinze emostatiche, pinze vascolari, e morsetti investigatore progettati 8,9,10,11,12. Gli investigatori hanno anche utilizzato vari metodi di marcatura del sito procurando lesioni sutura, particelle di carbonio e perline fluorescenti 13,14,1. Descriviamo il nostro metodo per ottenere uno schiacciamento del nervo sciatico riproducibile completa con un accurato e persistente marcatura del crush-sito utilizzando una pinza emostatica e sottili di carbonio conseguente schiacciamento-site marcatura. Come parte della nostra descrizione della procedura crush del nervo sciatico abbiamo anche incluso un metodo relativamente semplice di montare tutto muscoli che usiamo per quantificare successivamente rigenerazione.
Protocollo
1. Soggetti animali
1,1. Trattamento
- Tutte le procedure sugli animali deve essere effettuata con l'approvazione della Animal Care dell'istituzione locale e del comitato etico e in conformità con l'uso e il Comitato e le linee guida dei National Institutes of Health, con le misure adottate per ridurre al minimo il dolore e disagio.
- I nostri topi sono stati alloggiati in condizioni di temperatura controllata di 12 ore di luce di retromarcia e del ciclo di scuro, mentre il mouse alimentato chow e acqua ad libitum.
- Per gli studi di rigenerazione adulto, topi deve essere di almeno 6 settimane di età, qua....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Abbiamo presentato un metodo per ottenere uno schiacciamento del nervo sciatico affidabile completo con marcatura precisa del sito cotta. Come accennato in precedenza, crush del nervo sciatico è un modello comune di lesione dei nervi periferici nei topi e nei ratti. Sebbene ogni metodo di compressione ha i suoi vantaggi e svantaggi, abbiamo trovato questo metodo ha prodotto una cotta completo che era facilmente contrassegnata con un minimo di attrezzature speciali (ad esempio pinze speciali, ecc.)
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal NIH K08NS065157 (al TAF) Inoltre, il Centro Penn per disordini muscoloscheletrici, Numero P30AR050950 Award dal National Institute of Arthritis, malattie del sistema muscoloscheletrico e Pelle sostenuto questo lavoro (TAF e Steven S. Scherer). Infine, Shriners Pediatric Research finanziamento Seed Center (TAF) ha sostenuto questo lavoro. Vorremmo ringraziare il dottor Young-Jin Son inizialmente per dimostrare tutta la procedura di montaggio e di Amy A. Kim per la sua assistenza nella produzione i disegni della figura 1.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome (descrizione / quantità) | Fornitore | Numero di catalogo | |
| Clipper Mini 0000 il n Lama | Roboz | RC-5903 | |
| Nair Remover Capelli (9 oz.) | Chiesa e Dwight Co., Inc. | N / A | |
| Betadine Scrub chirurgico (1 gallone) | Fisher Scientific | 19066452 | |
| Unguento oftalmico (1 oz.) | Fisher Scientific | 19082795 |
Strumenti chirurgici:
| Nome (descrizione / quantità) | Fornitore | Numero di catalogo |
|---|---|---|
| FST 250 Hot tallone sterilizzatore | Strumenti di Scienza Fine | 18000-45 |
| Scissors Iris (11 cm di lunghezza) | Mondo Strumenti di precisione | 500216 |
| Potts-Smith Pinza (Straight, 18 centimetri; 1x2 Teeth) | Strumenti di Scienza Fine | 11024-18 |
| McPherson-Vännäs Scissors (5 lame mm) | Mondo Strumenti di precisione | 14124-G |
| Dumont # 5 - Pinza Dumoxel standard Tip | Strumenti di Scienza Fine | 11252-30 |
| Dumont # 5/45 - Pinza Dumoxel standard Tip | Strumenti di Scienza Fine | 11251-35 |
| Ultra hemostats Arti (Diritto; superfici interne lisce) | Strumenti di Scienza Fine | 13020-12 |
| Carbone attivo in polvere (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
| Dimensione 6-0 suture con C-1 ago (sterile, Seta, Nero, intrecciato,Non assorbibile, 18 "Length, Box di 36) | Roboz | SUT-1073-1011 |
| Reflex Applier Clip (per 9 clip mm) | Mondo Strumenti di precisione | 500345 |
| 9 mm in acciaio inossidabile Clips Reflex (100/box) | Mondo Strumenti di precisione | 500346 |
Animal Care:
| Nome (descrizione / quantità) | Fornitore | Numero di catalogo |
|---|---|---|
| 0,9% cloruro di sodio per iniezione (conservanti, 20 mL) | Hospira | 0409-4888-20 |
| Sistema completo Blanket omeotermi con sonda flessibile (Medium, 115 VAC, 60 Hz) | Harvard Apparatus | 507222F |
Platfor chirurgicom retrattori di:
(Acquistato nel negozio di ferramenta locale)
| Nome (descrizione /) | Quantità |
|---|---|
| Piattaforma in acciaio inossidabile (Lavorato; x1 ~ 12 "x12" / 8 ") | 1 |
| Magneti Button (Esempio: Eclipse e825) | 3 |
| Viti in acciaio inox (3 "Long; Diametro Determinato da Magneti Button) | 3 |
| Dadi in acciaio inox (di dimensioni adatte a Bulloni) | 9 |
| Elastici (Tension Light) | 3 |
| Pins insetti (entrambe le estremità piegate a formare ganci) | 3 |
Semi-Fluidifica:
| Nome (descrizione / quantità) | Fornitore </ Strong> | Numero di catalogo |
|---|---|---|
| Paraformaldeide (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodio fosfato bibasico anidro (500 g; utilizzato per preparare tampone fosfato) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodio fosfato monobasico anidro (1 kg, utilizzati per preparare tampone fosfato) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| Glutaraldeide (50%, 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18431 |
| Osmio di diazoto (4% acquosa, 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18465 |
| Ossido di propilene (450 mL) | Ted Pella, Inc. | 18601 |
| Incorpora 812 (Kit, per i blocchi duri / contrasto immagine ad alta) | Scienze della microscopia elettronica | 14120 |
| Toluidine blu (25 g) | Ted Pella, Inc. | 19451 |
Tutta Monte Preparazione muscolare e Immunoistochimica:
| Nome (descrizione / quantità) | Fornitore | Numero di catalogo |
|---|---|---|
| Paraformaldeide (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodio fosfato bibasico anidro (500 g; utilizzato per preparare tampone fosfato) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodio fosfato monobasico anidro (1 kg, utilizzati per preparare tampone fosfato) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| 10% di BSA diluente / Blocking Solution (200 mL) | Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. | 50-61-00 |
| Triton X-100 (100 mL) | Dot scientifico Incorporated | 9002-93-1 |
| Glicina, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
| Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (causa del 12, 4 bottiglie oz) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
| Sylgard DOW 170 (2 Kit lb) | Fisher Scientific | NC9492579 |
| Insetti in acciaio inox Pins, Size 1, 100/PKG) | Strumenti di Scienza Fine | 26001-40 |
| Tetrametilrodamina-A-bungarotossina (0,5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
| Mouse anticorpo monoclonale contro SMI-312 (0,1 ml) | Covance | SMI-312R |
| Mouse anticorpo monoclonale contro SV2 (0,1 mL) | Developmental Studies ibridomi Bank (DSHB) | SV2 |
| Coniglio PolyAnticorpo clonale Contro GAP-43 | Novus Biologicals | NB300-143 |
| Flourescein capra coniugato anti-topo IgG, Fcy Subclass uno specifico | Jackson ImmunoResearch | 11 5-095-205 |
| DyLight 649 coniugata Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
| 4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI, dilactate; 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
| Vectashield Mezzo di montaggio (10 mL) | Vector Laboratories | H-1000 |
| SuperFrost Plus preparati microscopici (Bianco; Dimensioni: 75 x 25 mm, confezione da 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Fisherfinest Premium Occhiali copertina (dimensioni: 40 x 22 mm, confezione da 1 oz.) | Fisher Scientific | 12-548-5C |
Riferimenti
- Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo. J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).
- Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Esplora altri articoli
