Neuronal morphogenesis के अध्ययन के लिए तरीके:<em> पूर्व vivo</em> भ्रूण murine प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में आरएनएआई electroporation
Summary
प्रमस्तिष्क प्रांतस्था के विकास में जीन के समारोह की एक तेजी से मूल्यांकन आचरण करने के लिए, हम शामिल विधियों का वर्णन<em> पूर्व vivo</emPlasmids के electroporation निरोधात्मक शाही सेना (आरएनएआई) और murine भ्रूण प्रांतस्था में GFP सह व्यक्त. यह प्रोटोकॉल neurogenesis, neuronal प्रवास और dendrite और अक्षतंतु परिणाम सहित neuronal morphogenesis के रूप में सक्षम के चिकित्सकों के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी है.
Abstract
प्रमस्तिष्क प्रांतस्था उच्च संज्ञानात्मक कार्यों का निर्देशन. यह छह स्तरित संरचना एक के अंदर पहले, बाहर पिछले तरीके, जिसमें पहले जन्म न्यूरॉन्स निलय के करीब रहते हुए पिछले जन्म न्यूरॉन्स 1 मस्तिष्क की सतह की दिशा में पहला जन्म न्यूरॉन्स अतीत की ओर पलायन में उत्पन्न होता है. Neuronal 2 प्रवास के अलावा, सामान्य cortical समारोह के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया neuronal 3 morphogenesis के विनियमन है. जबकि neuronal morphogenesis प्राथमिक संस्कृतियों में इन विट्रो में अध्ययन किया जा सकता है, वहाँ कैसे इन प्रक्रियाओं ऊतक वातावरण में विनियमित रहे हैं से सीखा जा के लिए बहुत कुछ है.
हम तकनीक का वर्णन neuronal प्रवास और / या के मस्तिष्क प्रांतस्था 4,6 organotypic स्लाइस में morphogenesis का विश्लेषण. एक pSilencer संशोधित वेक्टर प्रयोग किया जाता है जो दोनों एक U6 प्रमोटर है कि डबल असहाय बाल के लिये कांटा शाही सेना ड्राइव और एक अलग अभिव्यक्ति कैसेट कि GFP प्रोटीन encodes ख संचालित होता हैया सीएमवी 7-9 प्रमोटर. हमारा दृष्टिकोण उम्मीदवार जीनों की विशिष्ट पछाड़ना पर neurite परिणाम में दोषों के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है और सफलतापूर्वक neurite 8 परिणाम के नियामकों के लिए एक स्क्रीन में इस्तेमाल किया गया है. क्योंकि केवल कोशिकाओं के एक सबसेट आरएनएआई constructs व्यक्त करेंगे, organotypic स्लाइस संभावित phenotypes की एक मोज़ेक विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. इसके अलावा, क्योंकि यह विश्लेषण vivo वातावरण में एक के पास सन्निकटन में किया जाता है, यह एक कम लागत प्रदान करता है और अज्ञात cortical समारोह के जीन के लिए ट्रांसजेनिक या पीटा जानवरों की पीढ़ी के लिए तेजी से वैकल्पिक है. अंत में, vivo electroporation प्रौद्योगिकी के साथ तुलना में, पूर्व vivo electroporation प्रयोगों की सफलता कुशल सर्जरी कौशल विकास पर निर्भर नहीं है और एक छोटा प्रशिक्षण समय और कौशल के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है.
Protocol
Discussion
इन तरीकों डबल असहाय आरएनए 8 hairpins और organotypic स्लाइस 4 कई विशिष्ट लाभ प्रदान की संस्कृति कूटबन्धन plasmids के पूर्व vivo electroporation शामिल. सबसे पहले, इन तरीकों के आरएनएआई व्युत्पन्न phenotypes की एक तेजी से मूल्यांकन क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ. शिरीन Bonni pSil GFP का निर्माण, चित्रा 1 के चित्रण के लिए डा. Alper, Uzun, और confocal माइक्रोस्कोपी के लिए Leduc Bioimaging सुविधा प्रदान करने के लिए धन्यवाद. ईएमएम Burroughs Wellcome कोष, एक NARSAD युवा जांचकर्ता पुरस्कार, और NIH NCRR Cobre RR018728-01 P20 से चिकित्सा विज्ञान के लिए कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित है. SBL NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01 द्वारा समर्थित है, और एनआरएसए 5T32MH019118-20 PHS से समर्थन प्राप्त हुआ है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
Riferimenti
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