Denna metod beskriver den användningen av Infraröd-färgämne baserade bildgivande system för detektion av H1N1 i bronchioalveolar sköljning (BAL) fluidum av infekterade möss vid en hög känslighet. Denna metodik kan utföras i en 96 – eller 384-brunnars platta, kräver <10 | il volym av testmaterial och har potential för samtidig screening av multipla patogener.
Influensa-virus är en respiratorisk patogen som orsakar en hög grad av morbiditet och mortalitet varje år i multipla delar av världen. Därför, är precisa diagnos av den infekterande-stammen och snabba high-throughput screening av stora skarorna av kliniska prover av största vikt för att kontrollera spridningen av pandemiska infektioner. Nuvarande kliniska diagnoser av influensainfektioner är baserade på serologisk testning, polymeras-kedjereaktion, direkta provexemplaret immunofluorescens och cellkultur 1,2.
Här, rapportera vi utvecklingen av en roman diagnostisk teknik användas för att detektera levande influensavirus. Vi använde mus-anpassad människa A/PR/8/34 (PR8, H1N1)-viruset 3 för att testa effekten av denna teknik att använda MDCK celler 4. MDCK-celler (10 4 eller 5 x 10 3 per brunn) odlades i 96 – eller 384-brunnars plattor, infekterade med PR8 och virala proteiner detekterades med användning av anti-M2-följt av ett IR-färgämne-konjugerad sekondary antikropp. M2 5 och hemagglutinin 1 är två stora markörproteiner användas i många olika diagnostiska analyser. Som sysselsätter IR-färgämne-konjugerade sekundära antikroppar minimerat den autofluorescens associerad med andra fluorescerande färgämnen. Den användningen av anti-M2-antikropp tillät oss att använda den antigen-specifik fluorescens intensiteten som en direkt metrisk av viral kvantitet. Att räkna fluorescensintensiteten använde vi LI-COR Odyssey-baserad IR scanner. Detta system använder två kanaler laserbaserade IR detekteringar att identifiera fluoroforer och skilja dem från bakgrundsljud. Den första kanalen hetsar vid 680 nm och emitterar vid 700 nm för att hjälpa kvantifiera bakgrunden. Den 2:a-kanalen detekterar fluoroforer om att exciterar vid 780 nm och emittera vid 800 nm. Scanning av PR8-infekterade MDCK-celler i den IR-scannern indikerade en virala titern-beroende ljusstark fluorescens. En positiv korrelation mellan fluorescensintensiteten för att virus titer med utgångspunkt från 10 2 -10 5 PFU kan vara konkvent observeras. Minimal men detekterbara positivitet ses konsekvent med 10 2 -10 3 PFU PR8 virustitrar visade mycket känsliga nära IR färgämnen. Den signal-till-brus förhållandet bestämdes genom att jämföra de mock-infekterade eller isotyp antikropp-behandlade MDCK-celler.
Med användning av de fluorescensintensiteterna från 96 – eller 384-brunnars formaterar plate, konstruerade vi schablonvärden vid titrerkurvorna. I dessa beräkningar, är den 1:e variabeln det virala titem medan den 2:a variabeln är den fluorescensintensitet. Därför, använde vi den exponentiella distributionen för att generera en kurva-fit-för att bestämma den polynomet relationen mellan de virala titrarna och fluorescens intensiteter. Sammantaget drar vi slutsatsen att IR färgpulverbaserat protein upptäckt system kan hjälpa till att diagnostisera infektera virusstammar och exakt räkna titern av de infekterande patogener.
Den senaste epidemin utbrott av fågelinfluensa i Sydostasien och en global rädsla för svininfluensan pandemin innebära enorma problem för människors hälsa och säkerhet. Kritisk fokus har ägnats att skapa vaccin för befintliga och nya stammar av influensavirus. Tillgång till snabba teknik med hög kapacitet för exakt detektering och noggranna virala beräkningar titer kommer oerhört förbättra behandlingen. De mest vanligen använda tekniker som utnyttjas för att beräkna-virus-titer inkludera plackbildande-och influensa hemagglutination-analyser. Plattan bildar analysen utvecklades först för att uppskatta bakteriofag titer och antogs av Renato Dulbecco för att beräkna djurens virustitrar 4. För att utföra denna analys, är 10-faldiga spädningar av influensa lager eller exemplar djur såsom BAL-vätska förberedd och 0,1 ml alikvoter inokuleras på monoskiktet av MDCK celler i 6-brunnsplattor. Det virus tillåts att adsorbera på de MDCK-celler följt av den adskicket av ett näringsmedium och agaros. Under inkuberingen, de ursprungliga infekterade cellerna frisätta viral avkomma som spred endast till de angränsande celler. Den cytopatogena effekten av den influensapositiva viral infektion producerar en cirkulär zon av infekterade celler som kallas ett plack. Varje plack är förmodligen bildad efter infektion av en enda cell med en enda virus partikel följt av replikation av-virus. Kontrast mellan de levande celler och de plaketter kan förstärkas genom att färgämnen såsom kristallviolett. En stor nackdel med denna analys är brist på reproducerbarhet och enorma variationer inom experiment. En annan analys som användes för att bestämma den influensa virala titern är den hemagglutineringsanalys. Den hemagglutininproteinet närvarande på ytan av det influensa-virus binder effektivt till N-acetylneuramin-syra-haltiga proteiner på däggdjurs-och aviär röda blodkroppar 1. Denna interaktion mellan det influensavirus och de erytrocyterna leder till agglutinering i form av ett gitter. Den l.Evel av agglutinering används för att uppskatta den titer av den influensa viruset i provkroppar. Erytrocyt agglutination assay används endast för att bestämma titrering av ett känt virus och kan inte användas för stammarnas registreringsnummer. Eftersom denna analys inte skilja mellan levande och de döda virus, är det svårt att få en exakt beräkning av virala titrar.
Nuvarande kliniska diagnoser av influensainfektioner är baserade på serologisk testning, polymeras-kedjereaktion, direkta provexemplaret immunofluorescens och cellkultur 1,6. Den nya metoden som beskrivs här också har klinisk och laborativ diagnostiska potential. Influensa upptäckt kit Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) och BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) använder immunokromatografi analys för att upptäcka viralt antigen såsom nukleoprotein 7. Med hjälp av dessa kit, detektion av virus kan uppnås inom 15 minuter, men alla negativa prover måste ytterligare screened genom att den cell kulturen-metoden. Olika studier har också rapporterat låg sensitivitet av dessa kit, i synnerhet när infektion var milt eller låg 8. I vår metod, detektera vi konsekvent så låg som 100 PFU av-virus. Detta tyder på vår teknik är användbar för att upptäcka H1N1-viruset i kliniska prover, även när infektionen är mild. En fluorescens-baserad metod för att upptäcka virala antigener har rapporterats, där antingen nasofaryngeala aspirat prover analyseras direkt eller ympades på ett monoskikt av mottagliga celler för virus förökning och efterföljande analyser 9. Men dessa metoder begränsade för diagnostiska ändamål och är inte lämpliga för beräkningar virustiter. Q-PCR-hjälper till att identifiera närvaron av viralt RNA och går inte uppskatta den infektiviteten av levande virus. Jämfört med dessa analyser kommer IR färgpulverbaserat analyssystem hjälp i att upptäcka och virustiter uppräkningen i kliniska och laboratorieprover. I händelse av influensa utbrott, är detkritisk för att diagnostisera tusentals prover i en kort tidsperiod. Vår metod bygger på en 384-brunnar och IR scanner kan scanna 6-plattor åt gången (> 2000 prover), och således erbjuder ett större fördel jämfört med andra direkta fluorescerande metoder. Genomförbarheten av en snabb behandling av tusentals kliniska prover kan minska testet variation, längd av analys tid och kostnader. Användningen av ett M2–specifik antikropp erbjuder fördelen av att vara oberoende av stamskillnader i H-och N-proteiner. M2-proteinet är relativt bevarad i de flesta influensastammar infekterar människor. Om så antikroppar som är specifika för att cirkulerande fläckar tas kombineras med vårt system en kan mäta både den titem av viruset och identifiera den-stammen. Eftersom M2 är målet för Amantadin-liknande läkemedel kan mutanter uppstå som kan ändra bindningsstället för mAb som används här. Detta representerar en potentiell begränsning för den här system i individer som håller på att behandlade genom dessa droger.
Multipelanalyser används för att räkna influensa titrar i testprover. För att beräkna-virus-titer, 50% vävnadskultur infektiös dos (TCID 50) och sektorn för ägg allantoiska fluidum-baserade analyser användes i stor utsträckning 1,10. Men kraven på flera dagar att göra dessa metoder mindre tillförlitlig. Vidare, i dessa metoder beräkningar som baseras på 50% förändring av antalet plack ge teoretiska, men inte exakt virala titreringar. Plackbildande analyser kan utföras inom 96 timmar, men är bristen på reproducerbarhet ett stort problem i virustiter beräkningar. Den föreliggande teknik som beskrivs här har flera distinkta fördelar. Först, är det en höggradigt reproducerbar teknik med konsekventa utfall. Andra, den virala antikroppnivåvärden Beräkningarna är baserade på enkel kvantifiering av fluorescensintensiteter som jämförs mot definierade standardkurvor. Tredje, kan två eller flera primära antikroppar användas för att diagnostisera multipla serotyper i ett givet prov. Också, IR-färgämne-konjugerade antikroppar har halvpausfl autofluorescens och har använts för cell imaging 11. UV-eller visuell strålning (300-600 nM) resulterar i hög cellulär autofluorescens på grund av närvaron av höga quantum avkastningsvalutor endogena fluoroforer. Dessa inkluderar aromatiska aminosyror, Lipo-pigment, pyridinic nukleotider (NADPH), elastin, kollagensjukdomar och flavin koenzymer. Den här inneboende egenskapen hos celler gör det svårt att utnyttja dessa källor till strålning som prober för att kvantifiera den expressionen av specifika proteiner. I motsats nära-IR färgämnen väcka och släpper mellan 670-1000 nm. Många värd cellulära molekyler och polyaromatiska kolväten inte hetsas inte denna våglängd och på grund av minskad ljusspridning, släpper extremt låg bakgrundsfluorescens. Ytterligare, är fönstret mellan bakgrunden och specifika detektionen vastly förbättrades på grund av en hög extinktionskoefficient av de i närheten av-IR-fluoroforer. Fotostabilitet, överlägsen signal-till-brus-förhållande, är extremt relevant i den kvantifiering av virala titrar. Bruk av microfluidic kamrar automatiserar screening processen genom robot kontroller och kunde tillåta oss att testa mycket smittsamma kliniska prover med lätthet. Sålunda, är utnyttjandet av i närheten av-IR-färgämnena i dessa metoder idealisk och mycket tillförlitlig att uppräkna virala titrar i vävnadsprover.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds delvis NIH bidrag R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (till SM). Vi tackar våra laboratorium medlemmar för diskussion och teknisk hjälp, Tina Heil för kritisk granskning av manuskriptet. Vi vill tacka David Bina, Milwaukee Health Department Laboratoriet för virusodling och PCR.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR-biosciences | 9201-01 | |
384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |