Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll, das zu sehen und zur quantitativen Beurteilung der Morphologie der dendritischen Baumes der einzelnen Purkinje-Zellen im Kleinhirn organotypischen Slice-Kulturen angebaut erlaubt. Dieses Protokoll soll Studien zu den Mechanismen der Purkinje-Zellen dendritische Entwicklung zu fördern.
Abstract
Purkinje-Zellen sind ein attraktives Modell für die Untersuchung dendritischen Entwicklung, weil sie eine beeindruckende Dendritenbaum die streng ausgerichtet ist in der Sagittalebene und entwickelt vor allem in der postnatalen Phase bei kleinen Nagern 3 haben. Darüber hinaus sind mehrere Antikörper zur Verfügung, die gezielt und intensiv Label Purkinje Zellen, einschließlich aller Prozesse, mit anti-Calbindin D28K die am meisten verbreitet. Zum Betrachten von Dendriten in lebenden Zellen sind Mäuse, die EGFP selektiv in Purkinje-Zellen 11 bis Jackson Labs zur Verfügung. Organotypische Kleinhirn Slice-Kulturen Zellen ermöglichen eine einfache experimentelle Manipulation der Purkinje-Zellen dendritische Entwicklung, weil die meisten der dendritischen Ausbau der Purkinje Zelle Dendritenbaum tatsächlich stattfindet während der Anzucht 4. Wir stellen Ihnen hier eine kurze, zuverlässige und einfach Protokoll für Ansicht und Analyse der dendritischen Morphologie der Purkinje-Zellen im organotypi gewachsenc Kleinhirn Slice-Kulturen. Für viele Zwecke ist eine quantitative Auswertung der Purkinje Zelle Dendritenbaum wünschenswert. Wir konzentrieren uns hier auf zwei Parameter, Größe und Dendritenbaum Verzweigungspunkt Zahlen, die sich schnell und einfach von anti-Calbindin gebeizt zerebelläre Schnittkulturen bestimmt werden kann. Diese beiden Parameter ergeben eine zuverlässige und empfindliche Messung der Veränderungen des Purkinjezelle Dendritenbaum. Am Beispiel der Behandlungen mit der Proteinkinase C (PKC) und der Aktivator PMA metabotropen Glutamat-Rezeptor 1 (mGluR1) zeigen wir, wie Unterschiede in der dendritischen Entwicklung visualisiert und quantitativ bewertet werden. Die Kombination des Vorhandenseins eines umfangreichen Dendritenbaum, selektive und intensive Immunfärbung Methoden organotypischen Kulturen, die die Periode des dendritischen Wachstums und einem Mausmodell Deckel mit Purkinje zellspezifische Expression EGFP machen Purkinjezellen ein leistungsfähiges Modellsystem für enthüllt die Mechanismen der dendritischen Entwicklung.
Protocol
Discussion
Die hier vorgestellten Verfahren ermöglichen Purkinjezelle dendritische Entwicklung in organotypischen zerebelläre Schnittkulturen studieren und quantitativ auszuwerten Purkinjezelle dendritischen Expansion durch Messen Dendritenbaum Größe und die Anzahl der dendritischen Verzweigungspunkte. Natürlich ist ein umfangreicher und ausgefeilte quantitative Analyse von Purkinje-Dendriten möglich, z. B. durch Bestimmung der gesamten dendritischen Länge, Durchführen einer Analyse oder Sholl Bestimmung der fraktalen Dime…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Universität Basel, Departement Biomedizin und der Schweizerischen National Science Foundation (31003A-116624) gefördert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue culture Inserts | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Horse serum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Rabbit anti-GFP | Abcam | Ab290 |
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