Germ-free Mouse Aşamalı Kolonizasyon sırasında Karaciğer metabolik değişiklikler Değerlendirilmesi 1 H-NMR Spektroskopi
Summary
İlerici bir kolonizasyon prosedürü daha ev sahipliği karaciğer metabolizması üzerine olan etkisini değerlendirmek için tarif edilir. Yüksek Çözünürlüklü Magic Angle İplik (İK MAS) bozulmamış biyopsi NMR profil hepatik metabolizma tarafından değerlendirilir Kolonizasyon NMR tabanlı metabolik profil mikrobiyal co-metabolitleri idrar atılımı değerlendirerek invazif olmayan izlenir.
Abstract
Bağırsak bakterileri bağışıklık koruma ve vitamin sentezi olarak bir dizi faydalar sağlayarak, ev sahibi homeostazı önemli ölçüde katkıda bulunduğunu çok iyi bilinmektedir. Ayrıca bu ekosistemin önemli bir metabolik organı ile ev sahipliği yaparak, hatırı sayılır bir miktarda besin kaynağı. Bağırsak florası ve metabolik sendrom arasındaki bağlantı, konak ve gut Mikrobiyota arasındaki metabolik etkileşimi anlamaya artan kanıtlar çerçevesinde modern biyolojinin önemli bir sorun haline geliyor. 1-4
Kolonizasyon (normalleşme süreci olarak anılacaktır), eski bir germ-free hayvan mikro-organizmaların kurulması atar. Doğumda meydana gelen doğal bir süreç olmakla birlikte, aynı zamanda bağırsak çiçek ekosistem kontrolü ve daha fazla ana metabolizması üzerindeki etkisini belirlemek için, yetişkin germ-free hayvanlarda kullanılmaktadır. Sömürgeleştirme sürecini kontrol etmek için yaygın bir yöntemdir, bir singl sonda yöntemi kullanmak içine veya mikro-organizmaların bir karışımı. Bu yöntem, çok hızlı bir kolonizasyon sonuçları ve 5 derece stresli olma dezavantajı sunar . Bu nedenle, stresi en aza indirmek için ve bakteriyel kurulması yavaş yavaş ev sahibi metabolizması üzerine etkisini gözlemlemek için daha yavaş bir kolonizasyon süreci elde etmek için yararlıdır.
Bu yazıda, bir tahribatsız metabolik profil tekniği kullanılarak kademeli bir kolonizasyon süreci sırasında hepatik metabolizma değişiklik değerlendirmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Biz, 1 H-NMR tabanlı metabolik profil mikrobiyal co-metabolitleri idrar atılımı tarafından yansıtılan bağırsak mikrobiyal metabolik aktivite değerlendirerek bağırsak mikrobiyal kolonizasyon izlemek için öneriyoruz . Bu bağırsak mikrobiyal aktivite, genellikle DGGE (denatüre edici gradient jel elektroforezi) fekal bakteri izlenmesi ile değerlendirildi bağırsak mikrobiyal ekosistem kararlı kurulması ötesinde istikrar takdir sağlar. 6kolonizasyonu konvansiyonel açık bir ortamda gerçekleşir ve kontrol grubu olarak hizmet verecek geleneksel hayvanlar, kirli kirli bir çöp tarafından başlatılan. Kemirgenler coprophagous hayvanlar olmak, bu, daha önce açıklandığı gibi, homojen bir kolonizasyon sağlar. 7
Karaciğer metabolik profil, 1 H NMR spektroskopisi İplik Yüksek Çözünürlüklü Magic Angle kullanarak sağlam bir karaciğer biyopsisi doğrudan ölçülür . Bu yarı-kantitatif bir tekniktir hücre yapısına zarar vermeden, hızlı bir şekilde değerlendirmek için, trigliserit, glikoz ve glikojen gibi önemli metabolitleri daha da ilerletmek için kolonizasyon süreci ve karaciğer metabolizmasını 7-10 arasındaki karmaşık bir etkileşim tahmin ediyoruz . Bu yöntem, herhangi bir doku biyopsisi 11,12 için de uygulanabilir .
Protocol
Discussion
Bu protokol, daha sağlam biyopsi 1 H İK MAS NMR profil ile değerlendirildi, gut Mikrobiyota, karaciğer metabolizması üzerine etkisini araştırmak için açık bir ortamda ilerici bir kolonizasyon usulü nitelendirdi . Kolonizasyonu literatürde çeşitli yöntemler tarif edilmiştir. Tanımlanmış bir Mikrobiyota hayvanlar kolonize için en yaygın yöntemlerden ağızdan sonda ile veya kontamine içme suyu 19,20. Fekal aşılama, daha önce 21 açıklandığı gibi de kullanıla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Açıklayıcı örnekler olarak kullanılan tüm NMR spektrumları, Nestlé tarafından mali olarak desteklenen bir daha önce yayımlanan bir çalışmada 7 türetilmiştir .
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 2.5 mm microtube | New Era | NE-H5/2.5-V-Br | |
| 1.7 mm capillary tube | Sigma-Aldrich | NORS175001 | |
| Capillary adapter | New Era | NE-325-5/1.7 | |
| Extraction rod | New Era | NE-341-5 | |
| HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit |
Bruker | HZ07213 | |
| Tool kit for 50 μL inserts | Bruker | B2950 | |
| Advance III 600 MHz NMR | Bruker | ||
| 1H HR MAS NMR solid probe | Bruker | ||
| Deuterium oxide 99.9 % | Sigma-Aldrich | 530867-1L | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP) |
Sigma-Aldrich | 269913 |
Riferimenti
- Cani, P. D., Delzenne, N. M. Gut microflora as a target for energy and metabolic. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 10, 729-734 (2007).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444, 1022-1023 (2006).
- Raoult, D. Obesity pandemics and the modification of digestive bacterial flora. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27, 631-634 (2008).
- Turnbaugh, P. J., Backhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome. Cell. Host. Microbe. 3, 213-223 (2008).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 43, 42-51 (2004).
- Muyzer, G., Smalla, K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie van Leeuwenhoek. 73, 127-141 (1998).
- Claus, S. P. Colonization-induced host-gut microbial metabolic interaction. MBio. 2, (2011).
- Waters, N. J. High-resolution magic angle spinning 1H NMR spectroscopy of intact liver and kidney: optimization of sample preparation procedures and biochemical stability of tissue during spectral acquisition. Anal. Biochem. 282, 16-23 (2000).
- Bollard, M. E. High-resolution 1H and 1H-13C magic angle spinning NMR spectroscopy of rat liver. Magnetic resonance in medicine. 44, 201-207 (2000).
- Lindon, J. C., Holmes, E., Nicholson, J. Pattern recognition methods and applications in biomedical magnetic resonance. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 39, 1-40 (2001).
- Tate, A. R. Distinction between normal and renal cell carcinoma kidney cortical biopsy samples using pattern recognition of (1)H magic angle spinning (MAS) NMR spectra. NMR. Biomed. 13, 64-71 (2000).
- Wang, Y. Topographical variation in metabolic signatures of human gastrointestinal biopsies revealed by high-resolution magic-angle spinning 1H NMR spectroscopy. Journal of Proteome Research. 6, 3944-3951 (2007).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. The review of scientific instruments. 29, 688-691 (1958).
- Nicholson, J. K., Holmes, E., Wilson, I. D. Gut microorganisms, mammalian metabolism and personalized health care. Nat. Rev. Microbiol. 3, 431-438 (2005).
- Martin, F. P. Effects of probiotic Lactobacillus paracasei treatment on the host gut tissue metabolic profiles probed via magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Journal of Proteome Research. 6, 1471-1481 (2007).
- Swann, J. R. Variation in Antibiotic-Induced Microbial Recolonization Impacts on the Host Metabolic Phenotypes of Rats. J. Proteome. Res. , (2011).
- Jacobs, D. M., Gaudier, E., van Duynhoven, J., Vaughan, E. E. Non-digestible food ingredients, colonic microbiota and the impact on gut health and immunity: a role for metabolomics. Curr. Drug. Metab. 10, 41-54 (2009).
- Beckonert, O. High-resolution magic-angle-spinning NMR spectroscopy for metabolic profiling of intact tissues. Nat. Protoc. 5, 1019-1032 (2010).
- Hooper, L. V., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Methods in microbiology. 31, 559-589 (2002).
- Rahija, R. J., Fox, J. G. Ch. 7. The mouse in biomedical research. , 217-234 (2007).
- Goodwin, B. L., Ruthven, C. R., Sandler, M. Gut flora and the origin of some urinary aromatic phenolic compounds. Biochemical Pharmacology. 47, 2294-2297 (1994).
- Koopman, J. P. ‘Normalization’ of germfree mice after direct and indirect contact with mice having a ‘normal’ intestinal microflora. Lab Anim. 20, 286-290 (1986).
- Nishikata, N., Shikata, N., Kimura, Y., Noguchi, Y. Dietary lipid-dependent regulation of de novo lipogenesis and lipid partitioning by ketogenic essential amino acids in mice. Nutrition and Diabetes. 1, 1-12 (2011).
- Spagou, K. A GC-MS metabolic profiling study of plasma samples from mice on low- and high-fat diets. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 879, 1467-1475 (2011).
- Sanchez-Patan, F., Monagas, M., Moreno-Arribas, M. V., Bartolome, B. Determination of microbial phenolic acids in human faeces by UPLC-ESI-TQ MS. J. Agric. Food. Chem. 59, 2241-2247 (2011).
- Roux, A., Lison, D., Junot, C., Heilier, J. F. Applications of liquid chromatography coupled to mass spectrometry-based metabolomics in clinical chemistry and toxicology: A review. Clin. Biochem. 44, 119-135 (2011).
- Ryan, D., Robards, K., Prenzler, P. D., Kendall, M. Recent and potential developments in the analysis of urine: a review. Anal. Chim. Acta. 684, 8-20 (2011).
- Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules. Biochem. Biophys. Res. Commun. 78, 99-105 (1977).
- Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance. J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1975).
- Bodenhausen, G., Ruben, D. J. Natural abundance 15N NMR by enhanced heteronuclear spectroscopy. Chemical. Physics. Letters. 69, 185-189 (1980).
- Fan, T. W. -. M. Metabolite profiling by one- and two-dimensional NMR analysis of complex mixtures. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
- Fan, T., Lane, A. Structure-based profiling of metabolites and isotopomers by NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 52, 48-48 (2008).
- Fonville, J. M. The evolution of partial least squares models and related chemometric approaches in metabonomics and metabolic phenotyping. Journal of Chemometrics. 24, 636-649 (2010).
- Merrifield, C. A. A metabolic system-wide characterisation of the pig: a model for human physiology. Mol. Biosyst. , (2011).
- Tugnoli, V. Molecular characterization of human gastric mucosa by HR-MAS magnetic resonance spectroscopy. International Journal of Molecular Medicine. 14, 1065-1071 (2004).
- Sitter, B. Comparison of HR MAS MR spectroscopic profiles of breast cancer tissue with clinical parameters. NMR Biomed. 19, 30-40 (2006).
- Beckonert, O. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat. Protoc. 2, 2692-2703 (2007).
