Enkel og robust In vivo Og In vitro Fremgangsmåde for at studere Virus Assembly
Summary
En enkel, effektiv og robust måde til at synkronisere levering af multiple virale komponenter til planteceller ved hjælp af<em> Agrobacterium</em>-Medieret transient ekspression er beskrevet. Denne fremgangsmåde er egnet til at studere replikationen indkapsling efterfulgt af<em> In vitro</em> Gensamling af ikke-virale bestanddele i genomet depleteret optiske virale spøgelser egnede til biomedicinske anvendelser.
Abstract
I virus med positiv-sense RNA genomer patogene for mennesker, dyr og planter, afkom Indkapsling til modne og stabil virioner er et kardinalpunkt fase under etablering af infektion i en given vært. Derfor undersøgelse af encapsidation tyder de oplysninger om know-how af mekanismen regulering viruskonstruktion at danne infektiøse viruspartikler. Sådanne oplysninger er afgørende for at formulere nye metoder til at bremse virus spredes og sygdomsbekæmpelse. Virus indkapsling kan studeres in vivo og di vitro. Genom indkapsling in vivo er en yderst reguleret selektiv fremgangsmåde involverer makromolekylære interaktioner og subcellulær rumopdeling. Derfor, studere fører til dissekere begivenhederne omfatter virus encapsidering in vivo ville give grundlæggende viden til at forstå, hvordan virus formere sig og samle. For nylig in vitro encapsidering er blevet udnyttet til forskning inden for biomedicinske imaging og terapeutiske anvendelser. Ikke-kappeklædte plantevirus står langt fremme i venture af di vitro indkapsling af negativt ladede fremmed materiale. Brome mosaikvirus (BMV), en ikke-kappeklædte multikomponent RNA-virus er patogene for planter, er blevet anvendt som et modelsystem til undersøgelse genom emballage in vivo og di vitro. Til indkapsling assays i Nicotiana benthamiana planter, Agrobacterium-medieret transient ekspression betegner som agroinfiltration, er en effektiv og robust metode til synkroniserede afgivelse og ekspression af flere komponenter til den samme celle. I denne fremgangsmåde bliver en suspension af Agrobacterium tumefaciens celler, der bærer binære plasmid vektorer, der bærer cDNA'er af desiredviral mRNA'er infiltreret ind i intercellulære rum withina blad med noget mere sofistikeret end en 1 ml engangssprøjte (uden nål). Denne proces resulterer i overførsel af DNA-insertet i planteceller, T-DNAinsertet er transient i kernen og derefter transskriberet af værten polymerase II, hvilket fører til forbigående ekspression. Den resulterende mRNA transkript (udjævnet og polyadenyleret) derefter eksporteres til cytoplasmaet til oversættelse. Efter 24 til 48 timers inkubering, kan dele af infiltrerede blade udtages prøver for microscopyor biokemiske analyser. Agroinfiltration tillader et stort antal (hundreder til tusinder) af celler kan transficeres samtidigt. Til in vitro indkapsling, er oprensede virioner i BMV dissocieret i capsidprotein ved dialysering mod dissociation puffer indeholdende calciumchlorid efterfulgt af fjernelse af RNA og ikke-dissocierede virioner ved centrifugering. Genom depleteret capsidprotein subunits derefter samles med ønskede virale genom komponenter eller ikke-virale bestanddele, såsom indocyanine farvestof.
Protocol
Discussion
Agroinfiltration fremgangsmåde præsenteres her kan bredt anvendes til en bred vifte af plantevirus. Et kendetegnende træk ved denne fremgangsmåde er synkroniseret afgivelse af multiple agroconstruct til den samme celle-en væsentlig ulempe almindeligvis er forbundet med rutinemæssigt anvendes mekanisk inokulering af plantevirus. In vivo og di vitro-samling studier med brome-mosaikvirus som et model kan udføres effektivt ved Følgende par tips. (i) for en vellykket infiltration af N. benthamia…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke flere medlemmer af laboratoriet for deres værdifulde forslag i udviklingen af agroinfiltration og in vitro-samling analyser. Dette arbejde blev finansieret af en bevilling fra University of California. Denne undersøgelse blev støttet i dele af en bevilling fra National Science Foundation (CBET-1.144.237).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MES Sodium salts | Sigma-aldrich | M2993 |
| Indocyanine green | Sigma-aldrich | I2633 |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model: L8-70M |
| Centricon-100 column | Millipore | YM-100 |
| Spectrophotometer | Cary 50, Varian Inc. | Part number 10068900 |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
Riferimenti
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
- Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. . Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).
- Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
- Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
- Sambrrok, J., Russel, D. W. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).
- Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
