Enkel och robust In vivo Och In vitro Tillvägagångssätt för att studera Virus Assembly
Summary
En enkel, effektiv och robust sätt att synkronisera leveransen av multipla virala komponenter till växtceller genom<em> Agrobacterium</em>-Medierad transient uttryck att beskrivas. Detta tillvägagångssätt är mottaglig för att studera replikering, följt inkapsling av<em> In vitro</em> Återmontering av icke-virala komponenter i genomet utarmat optiska virala spöken som är lämpliga för biomedicinska tillämpningar.
Abstract
I virus med positiv RNA-genom patogena för människor, djur och växter, avkomma inkapsling i mogna och stabila virioner är en kardinal fas under etablering av infektion i en given värd. Följaktligen dechiffrerar studie av inkapsling uppgifter om know-how av mekanismen reglera viruset församlingen att bilda infektiösa virioner. Sådan information är viktig att formulera nya metoder för att stävja virus sprids och sjukdomar. Virus inkapsling kan studeras in vivo och in vitro. Genome inkapsling in vivo är en starkt reglerad selektiv process där makromolekylära interaktioner och subcellulära uppdelningsåtgärder. Därför studerar vilket leder till dissekera händelser omfattar virus inkapsling in vivo skulle ge grundläggande kunskaper för att förstå hur virus förökar och montera. Nyligen in vitro inkapsling har utnyttjats för forskning inom området biomedicinsk imaGing och terapeutiska tillämpningar. Icke höljeförsedda växtvirus står långt fram i satsningen av in vitro inkapsling av den negativt laddade främmande material. Brome mosaikvirus (BMV), ett icke höljeförsedda multikomponent RNA-virus som är patogena för växter, har använts som ett modellsystem för att studera genomet förpackning in vivo och in vitro. För inkapsling analyser i Nicotiana benthamiana växter, Agrobacterium-medierad övergående uttryck, refererar till som agroinfiltration är en effektiv och robust teknik för den synkroniserade leverans och expression av flera komponenter till samma cell. I detta tillvägagångssätt är en suspension av Agrobacterium tumefaciens celler som bär binära plasmidvektorer som bär cDNA för desiredviral mRNA infiltreras i det intercellulära utrymmet withina blad med inget mer sofistikerat än en 1 ml engångsspruta (utan nål). Denna process resulterar i överföringen av DNA-insättningen i växtceller; den T-DNA-insatsen förblir transient i kärnan och därefter transkriberas av värden polymeras II, vilket leder till övergående uttryck. Den resulterande mRNA-transkript (tak och polyadenylerat) sedan exporteras till cytoplasman för översättning. Efter ungefär 24 till 48 timmars inkubation, kan sektioner av infiltrerade blad tas prov för microscopyor biokemiska analyser. Agroinfiltration medger ett stort antal (hundratals till tusentals) celler som skall transfekteras samtidigt. För in vitro inkapsidering, renade virioner av BMV dissocieras in kapsidprotein genom dialys mot dissociation buffert innehållande kalciumklorid, följt av avlägsnande av RNA och icke-differentierade virioner genom centrifugering. Genomet utarmade kapsidproteinet subenheter sedan ihop med önskade virala genomet komponenter eller icke-virala komponenter, såsom indocyanin färgämne.
Protocol
Discussion
Agroinfiltration tillvägagångssätt presenteras här kan allmänt tillämpas på ett brett spektrum av växtvirus. En kännetecknande egenskap hos detta tillvägagångssätt är synkroniserad avgivning av multipla agroconstruct till samma cell-en stor nackdel förknippad med rutinmässigt används mekanisk inokulering av växtvirus. In vivo och in vitro montering studier med användning av Brome mosaikvirus som en modell kan utföras effektivt genom Följande några tips. (i) för framgångsrik infil…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka flera medlemmar av labbet för deras värdefulla förslag i utvecklingen av agroinfiltration och in vitro montering analyser. Detta arbete har finansierats genom ett bidrag från University of California. Denna studie stöddes i delar av ett bidrag från National Science Foundation (CBET-1.144.237).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MES Sodium salts | Sigma-aldrich | M2993 |
| Indocyanine green | Sigma-aldrich | I2633 |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model: L8-70M |
| Centricon-100 column | Millipore | YM-100 |
| Spectrophotometer | Cary 50, Varian Inc. | Part number 10068900 |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
Riferimenti
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
- Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. . Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).
- Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
- Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
- Sambrrok, J., Russel, D. W. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).
- Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
