Ex vivo Herming av normale og unormale Menneskelig hematopoiesis
Summary
En 3D kultur system for hematopoiesis beskrives ved hjelp av menneskelig navlestrengsblod og leukemic benmargceller. Metoden er basert på bruk av en porøs syntetisk polyuretan stillas belagt med ekstracellulære matrix proteiner. Dette stillaset er tilpasningsdyktige for å imøtekomme et bredt spekter av celler.
Abstract
Blodkreft stamceller krever et unikt mikromiljøet for å opprettholde blod celle formasjon 1; benmarg (BM) er en kompleks tredimensjonal (3D) vev der hematopoiesis er regulert av romlig organisert cellulære microenvironments kalt nisjer 2-4. Organiseringen av BM nisjer er kritisk for funksjon eller dysfunksjon av normal eller ondartet BM 5. Derfor en bedre forståelse av in vivo mikromiljøet med en ex vivo parodiering ville hjelpe oss belyse de molekylære, cellulære og microenvironmental determinanter for leukemogenesis 6.
Foreløpig er hematopoetiske celler dyrket in vitro i to-dimensjonale (2D) vevskulturstudier kolber / brønn-plater 7 krever enten co-kulturen med allogenic eller xenogenic stromale celler eller tillegg av eksogene cytokiner 8. Disse forholdene er kunstig og skiller seg fra in vivo </em> mikromiljøet i at de mangler 3D cellulære nisjer og eksponere cellene til unormalt høye cytokin konsentrasjoner som kan resultere i differensiering og tap av pluripotency 9,10.
Heri presenterer vi en ny 3D beinmarg kultur system som simulerer in vivo 3D vekst miljøet og støtter multilineage hematopoiesis i fravær av eksogene vekstfaktorer. Den svært porøse Stillaset brukes i dette systemet laget av polyuretan (PU), forenkler høy tetthet cellevekst over en høyere spesifikk overflate enn den konvensjonelle monolayer kulturen i 2D 11. Vårt arbeid har vist at denne modellen støttes veksten av menneskelig ledningen blod (CB) mononukleære celler (MNC) 12 og primære leukemic celler i fravær av eksogene cytokiner. Denne romanen 3D mimikk gir en levedyktig plattform for utvikling av en menneskelig eksperimentell modell for å studere hematopoiesis og å utforske nye behandlinger for leukemi.
Protocol
Discussion
Den ex vivo 3D kultur systemet presenteres her gjør oss i stand til å etablere en 3D biomimicry av hematopoiesis som sammenfatter den opprinnelige BM arkitektur og cellulær fenotype uavhengig av eksogene cytokiner. 3D-modellen gir struktur og mikromiljøet som gjør at normale og unormale blodkreft cellene til å spre seg i forhold som ligner dem som møtte in vivo.
Valget av polymere stillaset materialet representerte et avgjørende skritt i biomimicry design. Viktige f…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Richard Thomas Leukemi Fund, Lady Tata Memorial Trust, den Northwick Park Hospital Leukemi Research Trust Fund og National Institute of Health Research (NIHR), Storbritannia.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue No |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 |
| PBS | Gibco | 14190-094 |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 |
| MTS | Promega | G3580 |
| Glutaraldehyde | Fluka Biochemika | 49624 |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10108-165 |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32272 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 |
| CD45-FITC | BD Pharmigen | 74895 |
| CD71-PE | BD Pharmigen | 555537 |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Pharmigen | 555570 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
Riferimenti
- Orkin, S., Zon, L. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Spradling, A., Drummond-Barbosa, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. J Biosci. Bioeng. 100, 28-35 (2005).
- Lo Celso, C. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Mantalaris, A., Bourne, P., Wu, J. Production of human osteoclasts in a three-dimensional bone marrow culture system. Biochem. Eng. J. 20, 189-196 (2004).
- Placzek, M. Stem cell bioprocessing: fundamentals and principles. J. R. Soc. Interface. 6, 209-232 (2009).
- Dexter, T., Testa, N., Prescott, D. . Methods in Cell Biology. 14, 387-405 (1976).
- Piacibello, W. Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and differentiation. Leukemia. 12, 718-727 (1998).
- Yoshida, T., Takagi, M. Cell processing engineering for ex vivo expansion of hematopoietic cells: a review. Biochemical Engineering Journal. 20, 99-106 (2004).
- Lim, M. Intelligent bioprocessing for haemotopoietic cell cultures using monitoring and design of experiments. Biotechnol. Adv. 25, 353-368 (2007).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Panoskaltsis, N. The development of a three-dimensional scaffold for ex vivo biomimicry of human acute myeloid leukaemia. Biomaterials. 31, 2243-2251 (2010).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Aqel, N., Panoskaltsis, N. Long-term cytokine-free expansion of cord blood mononuclear cells in three-dimensional scaffolds. Biomaterials. 32, 9263-9270 (2011).
- Safinia, L., Datan, N., Hohse, M., Mantalaris, A., Bismarck, A. Towards a methodology for the effective surface modification of porous polymer scaffolds. Biomaterials. 26, 7537-7547 (2005).
