Låst nukleinsyra Flödescytometri-fluorescens På plats Hybridisering (LNA flow-FISH): En metod för bakteriell små RNA-detektering

Summary

En roman med hög genomströmning Metoden beskrivs som möjliggör detektion och relativ kvantifiering av små RNA-och mRNA uttryck från enstaka bakterieceller med låst nukleinsyra sonder och flödescytometri-fluorescens<em> På plats</em> Hybridisering.

Abstract

Fluorescens in situ hybridisering (FISH) är en kraftfull teknik som används för att detektera och lokalisera specifika nukleinsyrasekvenser i cellens miljö. För att öka genomströmningen, kan fiskarna dock kombineras med flödescytometri (flow-FISH) för att möjliggöra upptäckt av riktade nukleinsyrasekvenser i tusentals enskilda celler. Som en följd erbjuder flow-FISH en klar fördel jämfört lysat / ensemble-baserad nukleinsyra detektionsmetoder eftersom varje cell behandlas som en självständig observation, vilket möjliggör starkare statistik och varians analyser. Dessa attribut har föranlett användning av fisk och flöde-FISH metoder i ett antal olika applikationer och nyttan av dessa metoder har framgångsrikt visats i telomerlängd beslutsamhet ^1,2, cellulär identifiering och genuttryck ^3,4, viral multiplikation i infekterade celler ^5, och bakteriella gemenskap analys och uppräkning^6.

Traditionellt har särdrag FISH och flöde-FISH metoder har överförs genom sonder DNA oligonukleotid. Nyligen har dock byte av sonder DNA-oligonukleotid med nukleinsyra-analoger som fisk och flöde-FISH-prober ökade både sensitivitet och specificitet för varje teknik på grund av den högre smälttemperaturer (T _m) av dessa analoger för naturliga nukleinsyror ^7,8 . Låst nukleinsyra (LNA) sonder är en typ av nukleinsyra analoga som innehåller LNA nukleotider spetsade under en DNA eller RNA-sekvens ^9,10. När den kombineras med flödes-fisk, har LNA sonder tidigare visat sig överlägsna konventionella DNA-prober ^7,11 och har med framgång använts för att upptäcka eukaryot mRNA ¹² och viralt RNA i däggdjursceller ^5.

Här kan vi utöka denna kapacitet och beskriver en LNA flow-FISH metod som möjliggör detektering av RNA i bakteries (figur 1). Närmare bestämt är vi intresserade av att upptäcka små icke-kodande reglerande RNA (sRNA) som har samlat ett stort intresse de senaste åren som de har visat sig fungera som viktiga reglerande element i många viktiga cellulära processer ^13. Det finns dock begränsade verktyg för att studera sRNAs och utmaningar att upptäcka sRNA i bakterieceller beror delvis på den relativt ringa storlek (typiskt 50-300 nukleotider i längd) och låg överflöd av sRNA molekyler samt den allmänna svårigheten i arbetslivet med mindre biologiska celler med varierande cellmembran. I denna metod beskriver vi fixering och permeabilzation villkor som bevarar strukturen i bakterieceller och tillåta penetration av LNA sonder samt signal steg förstärkning som möjliggör detektering av låg förekomst sRNA (Figur 2).

Protocol

1. LNA sonder och experimentell design Design LNA sonder som är den omvända komplement till ditt transkriberade sRNA / mRNA eller låta specialdesignade på www.exiqon.com . Om du använder egen design alternativ, vet du sekvensen, men inte LNA tillsatta mönster. Tillsättningen av varje LNA rester i en DNA eller RNA oligonukleotid resulterar i en ökning av T m mellan två och 10 ° C för en LNA-RNA hybridisering duplex 14. Helst ska utformas LNA sonder vara mellan 20-25 nukleotider i längd (längre sonder är svårare att syntetisera) och har en T m på mellan 85-90 ° C för RNA hybridisering. Efter att ha designat sekvensen, använd BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi eller jämföra sonden sekvensen till din lokala databas för att säkerställa att sonden är specifikt bara för din sRNA / mRNA av intresse. Vid beställning av LNA sond, lägga till en biotin-TEG ändring av 5 "slutet av LNA oligonukleotid. Den biotinylation är nödvändig för post-hybridisering färgning med en streptavidin-färgämne konjugat. Det är möjligt att lägga till denna ändring av 3 "slutet om det behövs, men förutom de 5" slutet är billigare och borde leda till högre avkastning. Tre negativa kontroller bör inkluderas i metoden: (i) ett "nej LNA kontroll där en LNA sond inte läggs under hybridisering steget, (ii) en" nej färgämne kontroll där LNA givaren är hybridiseras till Målet sRNA men hybridisering händelsen inte upptäcks på grund av frånvaron av fluorescerande färg, och (iii) en "icke-uttryckta sRNA / mRNA kontroll som använder en LNA sond som riktar en icke-existerande eller icke-uttryckt sRNA för att övervaka icke-specifik hybridisering. De specifika LNA Sonden här är ett komplement till de sRNA CsrB och har sekvensen 5'-biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 (LNA monomerer istora bokstäver). Efter mottagandet av frystorkat LNA, resuspendera med nukleasfritt vatten till 50 mikrogram / ml och lagra i 10-20 mikroliter alikvoter vid -20 ° C. Lösningar 8% paraformaldehye (PFA), 10% ättiksyra i PBS: Blanda 1 ml 32% PFA, 400 mikroliter ättiksyra, 400 mikroliter 10X PBS, pH = 7,4 och 2,2 ml nukleasfritt vatten. För frysta alikvoter, frysa i engångsbruk alikvoter vid -20 ° C utan ättiksyra. 60% dextransulfat: tillsätt 6,0 g dextransulfat till en 50 ml koniska rör och tillsätt vatten till en slutlig volym på 10 ml. Värm denna blandning till 65 ° C i ett vattenbad tills dextransulfat är upplöst (kan ta 1-2 timmar). Ytterligare vatten kan behöva tillsättas under hela lösningsgörande processen att upprätthålla en 10 mL volym. Alikvotera 60% dextransulfat lösning och förvara vid -20 ° C fram till användning. 2. Fixering Harvest 1×10 8 celler självlysande <em> Vibrio campbellii eller din bakterier av intresse och för över dem till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Denna mängd av celler ger tillräckligt utgångsmaterial för fyra flödes-FISH prov (en specifik LNA sond prov och tre negativa kontroller). Ytterligare 1,5 mL mikrocentrifugrör portioner bör samlas in om andra sRNA / mRNA arter måste testas. Pellets bakteriecellerna genom centrifugering vid 2300 xgi fem minuter. Kassera supernatanten genom att pipettera och återsuspendera cellerna i 400 mikroliter 1X PBS. För att denna blandning, tillsätt 400 mikroliter av en 8% paraformaldehye (PFA) och 10% ättiksyra i 1X fosfatbuffrad saltlösning (1X PBS) lösning, blanda väl och inkubera i 10 minuter vid 25 ° C blanda gång efter fem minuter. Alla inkubationer, om inte annat anges, utförs i en uppvärmd slang hållare. Handlingsprogrammet lösning bör beredas på nytt eller användas från frysta alikvoter efter tillsats av ättiksyra. Paraformaldehyd är en crosslinking fixativ att Helps att bevara cellmorfologin och behålla intracellulära RNA. Pellets cellerna från denna blandning genom centrifugering vid 4500 xgi två minuter och avlägsna supernatanten genom pipettering. Alla framtida steg som kräver centrifugering bör använda samma inställningar (7K, 2 min). Det är viktigt att notera att efter centrifugeringen supernatanterna bör tas bort genom att pipettera och inte dekantering. Tvätta cellerna två gånger med 400 mikroliter 1X PBS och resuspendera sista cellpelleten i 400 mikroliter 1X PBS. Cellerna är nu fast och kan förvaras vid 4 ° C i 400 mikroliter 1X PBS i upp till sju dagar. 3. Diethyl pyrocarbonate behandling Förbered 400 mikroliter av en 0,1% lösning av dietyl pyrocarbonate (DEPC) i 1X PBS (400 mikroliter av denna lösning är nödvändig för varje prov som ska testas så skala därefter). Den DEPC lösning bör beredas på nytt från en DEPC lager. DEPC behandlingen inaktiverar RNaser av carbethoxylation och minskarbakgrund signal. Tillsätt 400 mikroliter av 0,1% DEPC lösning till varje fast bakterie prov och blanda väl genom att pipettera. Inkubera denna blandning vid 25 ° C i 12 minuter. Tvätta cellerna två gånger med 400 mikroliter 1X PBS, pellets cellerna (7K, 2 min) och avlägsna supernatanten. 4. Permeabilization Tillsätt 1,0 mg lysozym till 1 ml Tris-EDTA-buffert (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) för en 1,0 mg / ml lösning. Denna lösning bör beredas på nytt. Tillsätt 800 mikroliter av 1 mg / ml lysozym lösning på celler, blanda genom att pipettera och inkubera vid 25 ° C i 30 minuter med enstaka blandning. Pellet cellerna (7K, 2 min) och avlägsna supernatanten. Lysozym fungerar som en permeabilization reagens genom hydrolyzing den peptidoglykan närvarande i bakteriella cellväggar. Förbered en 3,0 mikrogram / ml lösning av proteinas K i TE buffert. Denna lösning bör beredas på nytt från en 20 mg / ml proteinas K lager som förvaras vid -20 ° C.Proteinas K är ett serinproteas som smälter en mängd olika proteiner och hjälper tillgänglighet sonder och reagenser till RNA. Tillsätt 800 ìl av 3,0 mikrogram / ml proteinas K lösning på cellpelleten och blanda ordentligt genom att pipettera. Inkubera vid 25 ° C i 15 minuter med vortexa halvvägs genom inkubation. Pellet cellerna (7K, 2 min), avlägsna supernatanten och tvätta cellerna en gång med 400 mikroliter 1X PBS. Efter att tvätten supernatanten resuspendera cellerna i 400 mikroliter 1X PBS och tillsätt 100 ìl av resuspension i fyra nya 1,5 rör ml mikrocentrifug. Pellet cellerna (7K, 2 min) och avlägsna supernatanten. 5. Hybridisering Förbered 100 mikroliter av hybridisering buffert (HB) för varje prov. HB består av 50% formamid volymprocent, 10% dextransulfat av massan (lägg till 16,7 ìl av 60% dextransulfat lösning för varje 100 mikroliter), 1x Denhardt lösning, 50 mm natriumfosfat pH 7,0,2X natriumcitrat (SSC), 20 mikrogram klippt lax spermier DNA (SSSD) och 20 mikrogram jäst tRNA. Var och en av komponenterna i HB har ett annat syfte. Formamid sänker smälttemperatur nukleinsyra duplex och därmed bidra med denaturering av RNA och minimera cellskador. Dextransulfat används som en volym exklusive polymer att koncentrera sonden och öka hybridisering takt. Denhardts lösning, jäst tRNA och SSSD fungera som en blockerande medel för att reducera icke-specifik bindning. I varje cell resuspension innehållande 1,5 ml rör mikrocentrifug, tillsätt 95 mikroliter HB och 5,0 ìl av sRNA / mRNA-specifik LNA [20 pmol av specifika LNA slutliga koncentrationen] eller vatten (för ingen LNA negativ kontroll). Till exempel: Rör 1 till 95 mikroliter HB + 5,0 mikroliter sRNA / mRNA-specifik probe Tube 2 till 95 mikroliter HB + 5,0 mikroliter sRNA / mRNA-specifik probe ("ingen färg" negativ kontroll) Tube 3 till 95 mikroliter HB + 5,0 mikroliter sRNA/ MRNA sond (icke uttryckt sRNA / mRNA "negativ kontroll) Tube 4 till 95 mikroliter HB + 5,0 mikroliter vatten (nej LNA "negativ kontroll) Inkubera alla fyra prover vid 60 ° C i 60 minuter. Den hybridisering temperatur beror på LNA sond (s) T m och bör sättas på ca 30 ° C under de förväntade T m för RNA glödgning. Både den förhöjda hybridisering temperatur och formamid i HB garanterar denatureras av sekundära struktur sRNA eller mRNA av intresse. 6. Post-hybridisering tvättar Efter hybridisering, tillsätt 1,0 ml 0,1 x Rymdbolaget med 0,1% Tween-20 (SSCT) till hybridisering blandningen. Detta är nödvändigt för att cellerna tas bort från den trögflytande hybridisering lösningen. Pellet cellerna (7K, 2 min) och avlägsna supernatanten. Tillsätt 200 mikroliter av 50% formamid, 2X Rymdbolaget, 0,1% Tween-20 till cellen pellets, blanda noggrant och incubåt i 30 minuter vid 65 ° C i ett värmeblock. Tillsätt 1 mL 0,1 x SSCT till blandningen, pellets cellerna (7K, 2 min) och avlägsna supernatanten. Tillsätt 500 mikroliter 0,1 x SSCT att resuspendera cellerna och inkubera i 40 minuter vid 65 ° C i ett värmeblock. Pellet cellerna (7K, 2 min) och avlägsna supernatanten. 7. Blockera och färgning Förbered blockerande buffert (BB) och streptavidin-dye färglösningen. Förbered en 1X BB lösning från en 5X lager (kommersiellt tillgängliga, se reagenser). För varje uppsättning av fyra rör, förbereda 1,2 ml 1X BB. Tillsätt 200 mikroliter 1X BB till cellen pellets, resuspendera och inkubera i 30 minuter vid 25 ° C. En streptavidin-konjugerade färgämne används för att upptäcka biotinylerad LNA sonder. Medan blockering, förbereda en lösning av 2 mikrogram / ml DyLight 488 streptavidin eller önskad färg-streptavidin konjugat i 1X BB i 30 min (för tre prover, göra 300 mikroliter). Efter incubation med 1X BB, pellets cellerna (7K, 2 min) och avlägsna supernatanten. Tillsätt 50 mikroliter av streptavidin-dye lösning på cellen pellets, blanda väl och inkubera i 12 minuter vid 25 ° C med konstant blandning på en virvel eller i en thermomixer. För nej färgen "kontroll, lägg till 50 mikroliter 1X blockeringsbuffert bara. För resten av protokollet, skydda rören från ljus med hjälp av aluminiumfolie. Tvätta cellerna en gång med 500 mikroliter 0,1 x SSCT buffert och en gång med 400 mikroliter 1X PBS med 0,1% Tween-20 (PBST). Pellet cellerna (7K, 2 min) och avlägsna supernatanten. Efter den inledande streptavidin-konjugat färgning, signalen förstärks genom att införa en biotinylerad anti-streptavidin antikropp till streptavidin-dye konjugatet och därefter färgning en andra gång med streptavidin-dye därmed öka signalen produktion per hybridiseras LNA sond (Figur 2) . Tillsätt 100 mikroliter av 1 mikrogram / ml biotinylerad anti-streptavidin antikropp i 1X PBS, resuspend cellerna och inkubera vid 25 ° C i 30 minuter med enstaka blandning. Pellet cellerna (7K, 2 min), avlägsna supernatanten och tvätta två gånger med 400 mikroliter 1X PBST. Tillsätt 50 mikroliter av 2 mikrogram / ml streptavidin-dye lösning på celler, blanda väl och inkubera i 12 minuter vid 25 ° C med konstant blandning på en virvel eller i en thermomixer. För nej färgen "kontroll, lägg till 50 mikroliter 1X blockeringsbuffert bara. Tvätta cellerna en gång med 500 mikroliter 0,1 x SSCT buffert och en gång med 400 mikroliter 1X PBST. Resuspendera cellerna i 200 mikroliter 1X PBST och förvara vid 4 ° C tills för flödescytometri analys. För mindre bakterieceller ställa flödet att sakta minska kärnan storleken. Dessutom, för flödescytometrar med framåt cutoffs scatter tröskel måste cutoff sättas så lågt som möjligt för att de små bakteriecellerna upptäcks. För DyLight 488 detektering bör flödescytometern vara utrustad med en 488 nm laser och standard utsläppfilter för FITC. Minst 2×10 4 händelser ska samlas in. För kompatibilitet med flödescytometrar utrustad med olika lasrar kan andra streptavidin-konjugerade fluoroforer användas för detta protokoll. 8. Representativa resultat Ett exempel på celler som är fasta och permeabilized effektivt visas i flödescytometri dot plot i figur 3A. När du använder de villkor som beskrivs ovan för permeabilization är cellpopulation liten och homogen visar några cellaggregat. När högre (5 mg / ml) koncentrationer av lysozym används celler är mer benägna att aggregera och visa ökad Forward Scatter värden indikerar större partiklar (Figur 3B). Ett exempel på uppgifter flödescytometri från en lyckad LNA flow-FISH experiment visas i Figur 4. Histogrammet visar för detektering av ett mål sRNA tillsammans med tre negativa kontroller.Den "ingen färg" negativa kontroll producerar minst fluorescens, följt av "nej LNA" och "icke-uttryckta sRNA 'negativa kontroller. Slutligen producerar provet med sRNA-specifika LNA sond störst fluorescens. När metoden och sonder LNA valideras på detta sätt kan ytterligare experiment utformas för att övervaka förändringar i sRNA signalen över tiden, som svar på mutationer eller varierande villkor kultur etc. Figur 1. Avbildningar av den övergripande planen för en LNA flow-FISH experiment för detektion av bakterier sRNA. Figur 2. Färgning och spridning av LNA flow-FISH signal. a) Hybridisering av biotinylerad LNA sonden. b) Färgning med fluorescerande DyLight 488 streptavidin konjugat. c) Bindande av biotinylerad anti-streptavidin antikropp mot DyLight 488 streptavidin. Antikroppen kan binda streptavidin genom sitt antigen-bindande plats eller kan vara bunden av streptavidin genom dess biotin rester. d) Förstärkning av signalen genom att ytterligare färgning med den fluorescerande DyLight 488 streptavidin konjugat. Figur 3. Flödescytometri dot tomter som visar framåt mot resultat Side Scatter för en) 1 mg / ml lysozym, 3 mikrogram / ​​ml proteinas K permeabilization och b) 5 mg / ml lysozym, 3 mikrogram / ​​ml proteinas K permeabilization. Figur 4. Histogram analys av LNA flow-FISH resultat. Den fluorescerande signal genereras från varje prov visas av fyra spår: svart – sRNA-specifika LNA probe, röd – icke uttryckt sRNA "negativa kontroll, blå – nej LNA" negativa kontroll, lila -"Ingen färg" negativ kontroll.

Discussion

Den LNA flow-FISH-metoden som presenteras här har använts för att upptäcka uttryck för en sRNA från gramnegativa marina bakterien Vibrio campbellii vars uttryck har tidigare bekräftats via microarray-baserade expression profiling och omvänd transkription polymerase chain reaction ^16. Hittills har vi använt denna metod för att övervaka ett uttryck för en mängd RNA (t.ex. trans-kodade sRNA, sRNA som modulerar protein aktivitet, riboswitches och mRNA). Som sådana är vi övertygade om att metoden är anpassningsbar och kan användas för att upptäcka eventuella sRNA eller mRNA mål och kan modifieras för användning i alla bakteriearter eller celltyp. Om ändringar av detta protokoll är nödvändigt för andra celltyper, är den viktigaste variabeln att överväga manipulera permeabilization steg. Till exempel, när ändra permeabilization förhållanden som beskrivs här, bör förändringar i koncentrationer av lysozym och proteinas K testas. Vi fann att en fördubbling ellertredubbling mängden av lysozym och proteinas K resulterade i stora förändringar i LNA flow-FISH resultat. Dessutom när man testar ytterligare permeabilization villkor bör cellerna analyseras för bildning av celler förlust, och det bästa erhållas signal till bakgrundsfluorescens förhållande. Omfattningen av cellen klumpar kan testas för med mikroskopi och / eller flödescytometri. Med flödescytometri, cell-klumpar är närvarande som svansar i en framåt mot Side Scatter dot plot och rätt permeabilization metoden kommer att minimera denna förföljer effekt. Denna metod är också mottaglig för multiplex sRNA upptäckt utan större ändringar i den beskrivna protokollet som extra LNA sonder märkta med andra haptener som digoxigenin kan läggas under hybridisering steget och sedan detekteras med en anti-digoxigenin antikropp och sekundär antikropp-fluoroforen konjugat. För närvarande är den enda begränsningen som vi har stött på med den här metoden dess oförmåga att generera tillräcklig signal från svagt extrycks sRNA arter och ansträngningar pågår för att bestämma detektionsgränsen (i absoluta antal kopior per cell).

Sammantaget ger LNA flödet-FISH-metoden möjlighet att mäta bakteriell sRNA eller mRNA-uttryck vid enskild cell-nivå i en hög genomströmning sätt att ge insikter om förekomst och relativa förekomsten av en sRNA arter och i vilken grad sitt uttryck varierar i en population.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Applied Biosystems/Ambion	AM9625
Nuclease-free water	Applied Biosystems/Ambion	AM9932	(not DEPC treated)
32% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15714	Ethanol free
Acetic acid	Acros Organics	327290010
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758	Keep desiccated
Lysozyme	Sigma Aldrich	L2879
Proteinase K (20 mg/mL)	Applied Biosystems/Ambion	AM2546
Formamide	Applied Biosystems/Ambion	AM9342	Deionized, aliquot and freeze
Dextran sulfate MW > 500,000	Sigma Aldrich	D8906	Aliquot 60% solution and freeze
Denhardt’s solution 50X concentrate	Sigma Aldrich	D2532	Aliquot and freeze
Sodium citrate buffer 20X	Applied Biosystems/Ambion	AM9770
Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL	Applied Biosystems/Ambion	AM9680	Aliquot and freeze
Yeast tRNA (10 mg/mL)	Life Technologies/Invitrogen	15401-011	Aliquot and freeze
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
5X in situ hybridization blocking solution	Vector Laboratories	MB-1220
DyLight 488 streptavidin	Vector Laboratories	SA-5488-1
Biotinylated anti-streptavidin	Vector Laboratories	BA-0500	Aliquot and freeze