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È stato sviluppato un protocollo per superare le difficoltà di isolare e caratterizzare le cellule T rare specifiche per i patogeni, come il papillomavirus umano (HPV), che causano infezioni localizzate. I passaggi coinvolti sono l'identificazione delle regioni delle proteine HPV che contengono epitopi delle cellule T di un soggetto, la selezione delle cellule T peptide-specifiche in base alla secrezione di interferone-γ (IFN-γ) e la crescita e la caratterizzazione dei cloni delle cellule T (Fig. 1). Il soggetto 1 era un paziente a cui era stata recentemente diagnosticata una lesione intraepiteliale squamosa di alto grado mediante biopsia ed era stato sottoposto a procedura di escissione elettrica ad ansa per il trattamento il giorno in cui le cellule T sono state raccolte1. Una regione all'interno delle proteine E6 ed E7 del papillomavirus umano di tipo 16 (HPV 16) che conteneva un epitopo di cellule T è stata identificata utilizzando un test ELISPOT (IFN-g enzyme-linked immunospot) eseguito con peptidi sintetici sovrapposti (Fig. 2). I dati di questo test sono stati utilizzati non solo per identificare una regione contenente un epitopo di cellule T, ma anche per stimare il numero di cellule T specifiche per l'epitopo e per isolarle sulla base della secrezione di IFN-γ utilizzando biglie magnetiche disponibili in commercio (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Le cellule T secernenti IFN-γ selezionate sono state diluite e coltivate singolarmente in presenza di una miscela di cellule feeder irradiate al fine di supportare la crescita di una singola cellula T per pozzetto. Questi cloni di cellule T sono stati sottoposti a screening utilizzando un saggio ELISPOT γ IFN- in presenza di peptidi che coprono la regione identificata e di cellule B linfoblastoidi trasformate (LCL) autologhe da virus di Epstein-Barr, ottenute come descritto da Walls e Crawford)2 al fine di ridurre al minimo il numero di cellule clone di cellule T necessarie. Invece di utilizzare 1 x 105 cellule per pozzetto, tipicamente utilizzate nei saggi ELISPOT1,3, sono state utilizzate 1.000 cellule clone di cellule T in presenza di 1 x 105 LCL autologhi, riducendo drasticamente il numero di cellule clone di cellule T necessarie. Gli LCL autologhi servivano non solo a presentare antigeni peptidici alle cellule clone delle cellule T, ma anche a mantenere un'alta densità cellulare nei pozzetti, consentendo alle cellule clone delle cellule T specifiche dell'epitopo di secernere IFN-γ. Ciò garantisce il successo dell'esecuzione del saggio ELISPOT con IFN-γ. Allo stesso modo, i saggi IFN- γ ELISPOT sono stati utilizzati per caratterizzare la sequenza aminoacidica minima e ottimale dell'epitopo delle cellule T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) e il suo elemento di restrizione HLA di classe I (B58). Il test γELISPOT è stato eseguito anche utilizzando LCL autologhi infettati con virus vaccinia che esprimono la proteina HPV 16 E6 o E7. Il risultato ha dimostrato che l'epitopo delle cellule T E6 è stato elaborato endogenamente. È stato dimostrato il riconoscimento incrociato dell'epitopo omologo delle cellule T di altri tipi di HPV ad alto rischio. Questo metodo può essere utilizzato anche per descrivere gli epitopi delle cellule T CD44.