نماذج مامي لتصوير الخلايا الحية 4D من ورم: التفاعلات المكروية أن التقدم تأثير الخبيثة
Summary
قمنا بتطوير نماذج coculture 3D لحية خلية التصوير في الوقت الحقيقي من التفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا الطبيعية الأخرى في المكروية في أن تقدم إلى تأثير النمط الظاهري الغازية. ويمكن لهذه النماذج بمثابة الشاشات قبل السريرية على المخدرات لاستهداف نظير الصماوي التي يسببها بروتين، chemokine / خلوى وكيناز المسارات المتورطين في الغازية.
Abstract
قمنا بتطوير نماذج coculture 3D، والتي نحن مامي مصطلح (م 1 عماري rchitecture وم ngineering icroenvironment ه)، واستخدموه لحية خلية التصوير في الوقت الحقيقي من الخلية: التفاعلات الخلية. وكان هدفنا العام لتطوير النماذج التي تلخص في الهندسة المعمارية من آفات الثدي سابق للغزو لدراسة تقدم بها إلى النمط الظاهري الغازية. على وجه التحديد، قمنا بتطوير نماذج لتحليل التفاعلات بين المتغيرات الثدي ما قبل الخبيثة الخلايا الظهارية وأنواع أخرى من الخلايا السرطانية التي المكروية قد تورطت في تعزيز أو الحد من تطور خلايا الثدي الظهارية سابق للغزو لسرطان الأقنية الغازية. أنواع الخلايا الأخرى دراسته حتى الآن هي خلايا myoepithelial، الخلايا الليفية، الضامة والدم والخلايا اللمفاوية الاوعية الدموية الدقيقة البطانية. بالإضافة إلى نماذج مامي، والتي تهدف إلى تلخيص التفاعلات الخلوية داخل الثدي خلالتطور السرطان، وقمنا بتطوير نماذج قابلة للمقارنة لتطور سرطان البروستاتا.
نحن هنا لتوضيح الإجراءات اللازمة لإنشاء cocultures 3D جنبا إلى جنب مع استخدام خلايا حية التصوير وفحص التحلل البروتيني وظيفي لمتابعة عملية الانتقال من cocultures من سرطان الثدي الأقنية في الموقع (DCIS) الخلايا والخلايا الليفية إلى النمط الظاهري الغازية على مر الزمن، في هذه الحالة أكثر من 23 أيام في الثقافة. وcocultures مامي تتكون من طبقات متعددة. هي جزء لا يتجزأ الليفية في الطبقة السفلى من النوع الأول من الكولاجين. يتم وضعها على أن طبقة من الغشاء القاعدي المعاد (RBM) في الخلايا التي بذرت DCIS. يتم تضمين طبقة أعلى من الإدارة القائمة على النتائج النهائية 2٪، وتتجدد مع كل تغيير في وسائل الاعلام. إلى التحلل البروتيني صورة المرتبطة تقدم إلى النمط الظاهري الغازية، ونحن نستخدم صبغ مروي (DQ) فلوري البروتينات المصفوفة (DQ-الكولاجين أنا مختلطة مع طبقة من الكولاجين وأنا الرابع DQ-الكولاجين مختلطة مع طبقة وسطى من الميزانية العاديةم) ومراعاة الثقافات الحية باستخدام متحد البؤر المجهري. ويتم التقاط المقاطع البصرية، ومعالجتها وإعادة بنائها في 3D مع برنامج التصور Volocity. على مدار 23 يوما في cocultures مامي، والخلايا DCIS تتكاثر وتتجمع في الهياكل الغازية الكبيرة. الليفية الهجرة ويندمج في هذه الهياكل الغازية. تم العثور على شظايا بروتين فلوري من collagens بالتعاون مع سطح هياكل DCIS، intracellularly، وفرقت أيضا في جميع أنحاء المصفوفة المحيطة بها. الأدوية التي بروتين الهدف، chemokine / خلوى وكيناز المسارات أو تعديلات في تركيبة الخلوية من cocultures يمكن أن تقلل من الغازية، مما يوحي بأن ويمكن استخدام نماذج مامي والشاشات قبل السريرية للنهج علاجية جديدة.
Protocol
Discussion
كما ثبت، ويمكن استخدام cocultures مامي للخلية الحية التصوير في الوقت الحقيقي من التفاعلات بين المكونات الخلوية المختلفة التي تتألف منها وجود ورم الثدي والمكروية لها. في الدراسات الجارية في مختبرنا، وقد استخدمنا مامي cocultures لتحديد مسارات بروتين يرتبط مع الانتقال من DCIS لس?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل، في جزء منه، من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 CA131990 (BFS وRRM). تم تنفيذ الخلية الحية التصوير في الموارد الأساسية الميكروسكوب والتصوير والخلوي المعتمدة، في جزء منه، من قبل المعاهد الوطنية للصحة مركز منحة P30 CA22453 لمعهد السرطان كارمانوس، جامعة ولاية واين، وفرع بحوث الفترة المحيطة بالولادة من المعاهد الوطنية للصحة الطفل والتنمية ، جامعة واين ستيت.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) |
Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-col IV D12052 |
|
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific Co. | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza | MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136 |
Phenol red–free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
Riferimenti
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
