Per capire come forme cellulari complessi, come dendriti neuronali, vengono raggiunti durante lo sviluppo, è importante essere in grado di accuratezza dell'organizzazione test microtubuli. Qui si descrive un metodo robusto etichettatura immunoistologiche di esaminare l'organizzazione dei microtubuli dei dendriti arborizzazione dendritica neurone sensoriale, trachea, dei muscoli, e gli altri Drosophila Larva tessuti parete del corpo.
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Articolo metodologico
Etichettatura immunoistologiche di microtubuli in Neuron dendriti sensoriali, trachee, e Muscoli in Drosophila Larva parete del corpo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per capire come le differenze nelle forme cellulari complessi siano raggiunti, è importante seguire con precisione l'organizzazione dei microtubuli. Il corpo Drosophila larvale parete contiene diversi tipi di cellule che sono modelli per lo studio delle cellule e la morfogenesi dei tessuti. Per esempio trachee sono utilizzati per esaminare la morfogenesi del tubo 1, e la arborizzazione dendritica (DA) neuroni sensoriali della larva di Drosophila sono diventate un sistema primario per la delucidazione dei generali e dei neuroni-classe-specifici meccanismi di 2-5 differenziazione dendritica e degenerazione 6 .
La forma di rami dendrite può variare notevolmente tra le classi di neuroni, e anche tra i diversi rami di un singolo neurone 7,8. Studi genetici nei neuroni DA suggeriscono che la differenza di organizzazione del citoscheletro possono essere alla base delle differenze morfologiche di forma ramo dendritiche 4,9-11. Forniamo un robusto metodo di etichettatura immunologico ad unssay nell'organizzazione dei microtubuli vivo nei neuroni sensoriali DA dendrite pergolato (Figure 1, 2, Movie 1). Questo protocollo illustra la dissezione e immunocolorazione della prima larva instar, una fase in cui attivo escrescenza dendriti dei neuroni sensoriali e organizzazione ramificazione sta avvenendo 12,13.
Oltre alla colorazione neuroni sensoriali, questo metodo ottiene l'etichettatura robusto di organizzazione dei microtubuli nei muscoli (Film 2, 3), trachea (Figura 3, Movie 3), e di altri tessuti parete del corpo. E 'utile per gli investigatori che desiderano analizzare l'organizzazione dei microtubuli in situ nella parete del corpo durante l'analisi dei meccanismi di controllo che il tessuto e la forma delle cellule.
Protocollo
1. Preparazione dei reagenti
Note prima di iniziare: Dissection e colorazione immunoistochimica si svolgono in una camera magnetica e la larva è immobilizzato mediante perni di insetti forma speciale. Istruzioni dettagliate per la costruzione di una camera magnetica, e la preparazione di questi pin possono essere trovati nei riferimenti relativi 14,15. In breve, un foro quadrato 1x1cm viene tagliato in un foglio magnetico e un copri apposta sul retro del foglio per fare una piccola camera. I lati della camera sono sigillati con la colla epossidica, dopo questa colla ha fissato la camera è lavato più volte con eta....
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Discussione
Per capire come forme complesse cellule che sono raggiunto è importante essere in grado di accuratezza dell'organizzazione test microtubuli. Qui si descrive un metodo robusto etichettatura immunoistologiche all'organizzazione microtubuli dosaggio dei dendriti arborizzazione dendritica neurone sensoriale. Oltre alla colorazione neuroni sensoriali, questo metodo ottiene robusto colorazione immunoistologiche della trachea, dei muscoli e altri tessuti parete del corpo.
Noi utilizziamo qu.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo RIKEN per il finanziamento. P10-GAL4 è stato un gentile dono di Alain Vincent (Université Paul Sabatier di Tolosa, Francia).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Catalogo numero | Commenti (Opzionale) |
| Forcipe | Dumont | 11251-20 | |
| Microscissors | FST | 15000-08 | |
| Topo anti-α-tubulina (Clone: DM1A) | Sigma | T9026 | Diluizione 1 / 1000 |
| Topo anti-Futsch (Clone: 22C10), surnatante | Sviluppo Studi Ibridomi Banca | 22C10 | Diluizione 1 / 1000 |
| Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) | Caltag | MCD0800 | Diluizione 1 / 1000 |
| Alexa Fluor 488 IgG anti-topo | Invitrogen | A-11001 | Diluizione 1 / 500 |
| Cy3 IgG anti-Rat | Jackson ImmunoResearch | 712-166-150 | Diluizione 1 / 200 |
Riferimenti
- Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in....
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Ristampe e permessi
