Det Ex vivo Isolert Skeletal Microvessel Forberedelse for etterforskning av vaskulær reaktivitet
Summary
En<em> Ex vivo</em> Forberedelse er beskrevet for isolering av de største gracilis muskel motstand arterioler for avhør av både vaskulære svar vasoaktive stimuli og vurdering av grunnleggende strukturelle egenskaper via passive vegg mekanikk.
Abstract
Den isolerte microvessel preparatet er en ex vivo forberedelse som gjør det mulig for undersøkelse av de ulike bidrag fra faktorer som kontrollerer fartøy diameter, og dermed perfusjon motstand 1-5. Dette er en klassisk eksperimentell forberedelse som var, i stor grad, først beskrevet av Uchida m.fl. 15 flere tiår siden. Denne første beskrivelsen gitt grunnlag for teknikkene som ble omfattende endret og forbedret, først og fremst i laboratoriet av Dr. Brian Duling ved University of Virginia 6-8, og vi presenterer en aktuell tilnærming i de følgende sidene. Dette preparatet vil spesielt henvise til gracilis arteriole i en rotte som microvessel av valget, men den grunnleggende forberedelse kan lett brukes på skip isolert fra nesten alle andre vev eller organ på tvers av arter 9-13. Mekanisk (dvs. dimensjonal) endringer i den isolerte microvessels lett kan vurderessom svar på et bredt spekter av fysiologiske (f.eks hypoksi, intravaskulær press, eller skjær) eller farmakologisk utfordringer, og kan gi innsikt i mekanistiske elementer består integrert respons i en intakt, selv ex vivo, vev. Betydningen av denne metoden er at det gir mulighet for lettvinte manipulasjon av påvirkninger på den integrerte regulering av microvessel diameter, mens også noe som åpner for kontroll over mange av bidrag fra andre kilder, inkludert intravaskulært trykk (myogenic), autonome innervasjon, hemodynamiske ( f.eks skjærspenning), endotelceller avhengige eller uavhengige stimuli, hormonelle og parenkymatøs påvirkninger, for å gi en ufullstendig liste. Under egnede eksperimentelle forhold og med passende mål, kan dette tjene som en fordel fremfor in vivo eller in situ vev / organ preparater, som ikke lett lar for lettvinte kontroll av bredere systemiske variabler.
MAJor begrensning av dette preparatet er egentlig konsekvensen av sine styrker. Per definisjon er oppførselen til disse fartøyene blir studert under forhold hvor mange av de mest betydelige bidragsyterne til regulering av vaskulær motstand har blitt fjernet, inkludert neural, humoral, metabolsk, osv. Som sådan er det etterforskeren advares mot å over- tolkning og ekstrapolering av dataene som samles utnytte dette preparatet. Den andre betydelige område av bekymring med hensyn til dette preparatet er at det kan være veldig lett å skade cellulære komponenter som endotelial fôr eller vaskulær glatt muskulatur, kan slik at variable feilkilde bli innført. Det anbefales sterkt at den enkelte etterforsker utnytte egnede målinger for å sikre kvaliteten på forberedelse, både ved oppstart av forsøket og regelmessig i løpet av en protokoll.
Protocol
Discussion
Protokollen presenterte beskriver isolasjon, fjerning og dobbel kanylering av en skjelettmuskulatur microvessel, selv om denne generelle teknikken kan lett brukes på de fleste vev. For den nåværende manuskriptet, har begrepet «arteriole» blitt brukt av forfatterne å beskrive en motstand fartøy varierer mellom 70-120 mikrometer i diameter mindre enn hvile aktiv tone, som også er en stor bidragsyter til regulering av perfusjons motstand mot et organ eller vev.
Med noen modifikasjoner, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association (EIA 0740129N) og NIH T32 HL90610.
Materials
| Reagents and Equipment | Company | Comments/Catalogue # |
| Vessel Chamber | Custom | Dave Eick (MCW) |
| Heated Circulating Water Bath | PolyScience and Haake | Haake DC 10 |
| Pipets | Frederick Haer & Co. | Capillary Tubing 2.0 mm OD x 1.0 mm ID (27-33-1) |
| Pressure Monitor | World Precision Instruments | |
| Water Jacketed Reservoir | Custom | |
| External Light Source | World Precision Instruments | Novaflex |
| Pipet Puller | MicroData Instruments | PMP102 Micropipet Puller |
| Full complement of surgical tools | Fine Science Tools | Dumont |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | Inox #5 |
| Silk Suture Thread | Ethilon | #10-0 or 9-0 |
| Stereo Microscope | Olympus | Olympus SZ-11 |
| Analog Video Calipers | Boeckeler | Via Controller (Via-100) |
| High Resolution Analog Camera | Panasonic | GP-MF 602 |
| Oxygen Tank | Regional | 21% balance nitrogen and 5% CO2 balance nitrogen |
| Tubing | Tygon | |
| Drain Pump | Cole Parmer Instrument Co. | |
| Modified Rat PSS | See recipe below | |
| Van Breemen’s Relaxant PSS | See recipe below |
Table 1. A list of the major components of isolated microvessel station setup presented in the Figures.
| Modified Rat PSS Recipe | To make two liters of PSS | 20X Salt Stock (2L) | 20X Buffer Stock (2L) |
| NaCl | 278.0 g | ||
| KCl | 14.0 g | ||
| MgSO4-7H2O | 11.5 g | ||
| CaCl2-H2O | 9.4 g | ||
| NaHCO3 | 80.8 g | ||
| EDTA | 0.4 g | ||
| NaH2PO4 | 0.28 g | ||
| Glucose | 1.98 g | ||
| 20x Salt Stock | 100 mL | ||
| 20x Buffer Stock | 100 mL | ||
| Distilled Water | 1800 mL |
Table 2. Recipe for standard physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols.
Comments on Recipe: Make 2 L of Salt Stock and 2 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final PSS.
| Van Breemen’s Relaxant PSS | To make 2 liters of PSS | 20X Salt Stock (1L) | 20X Buffer Stock (1L) |
| NaCl | 107.4 g | ||
| KCl | 7.0 g | ||
| MgSO4-7H2O | 5.76 g | ||
| MgCl2-6H2O | 81.32 g | ||
| NaHCO3 | 40.4 g | ||
| EDTA | 0.2 g | ||
| EGTA | 15.22 | ||
| NaH2PO4 | 0.28 g | ||
| Glucose | 1.98 g | ||
| 20x Salt Stock | 100 mL | ||
| 20x Buffer Stock | 100 mL | ||
| Distilled Water | 1800 mL |
Table 3. Recipe for Van Breemen’s relaxant physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols under conditions of zero active tone.
Comments on Recipe: Make 1 L of Salt Stock and 1 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final relaxant PSS.
Riferimenti
- Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome. Microcirculation. , 1-18 (2009).
- Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Increased vascular thromboxane generation impairs dilation of skeletal muscle arterioles of obese Zucker rats with reduced oxygen tension. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H1522-H1528 (2008).
- Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Growth-dependent changes in endothelial factors regulating arteriolar tone. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, H207-H214 (2007).
- Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Hydrogen peroxide emerges as a regulator of tone in skeletal muscle arterioles during juvenile growth. Microcirculation. 15, 151-161 (2008).
- Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Increased myogenic responsiveness of skeletal muscle arterioles with juvenile growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2344-2351 (2008).
- Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduce PO2. Am. J. Physiol. 267, H706-H715 (1994).
- Durand, M. J., Raffai, G., Weinberg, B. D., Lombard, J. H. Angiotensin-(1-7) and low-dose angiotensin II infusion reverse salt-induced endothelial dysfunction via different mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H1024-H1033 (2010).
- LeBlanc, A. J., Cumpston, J. L., Chen, B. T., Frazer, D., Castranova, V., Nurkiewicz, T. R. Nanoparticle inhalation impairs endothelium-dependent vasodilation in subepicardial arterioles. J. Toxicol. Environ. Health A. 72, 1576-1584 (2009).
- Jernigan, N. L., LaMarca, B., Speed, J., Galmiche, L., Granger, J. P., Drummond, H. A. Dietary salt enhances benzamil-sensitive component of myogenic constriction in mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, H409-H420 (2008).
- Stapleton, P. A., Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Altered mechanisms of endothelium-dependent dilation in skeletal muscle arterioles with genetic hypercholesterolemia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 293, R1110-R1119 (2007).
- Goodwill, A. G., Stapleton, P. A., James, M. E., d’Audiffret, A. C., Frisbee, J. C. Increased arachidonic acid-induced thromboxane generation impairs skeletal muscle arteriolar dilation with genetic dyslipidemia. Microcirculation. 15, 621-631 (2008).
- Baumbach, G. L., Hadju, M. A. Mechanics and composition of cerebral arterioles in renal and spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 21, 816-826 (1993).
- Uchida, E., Bohr, D. F., Hoobler, S. W. A method for studying isolated resistance vessel from rabbit mesentery and brain and their responses to drugs. Circ. Res. 4, 525-536 (1967).
- Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. I. s. o. l. a. t. e. d., Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. Chapter 23. Isolated, perfused microvessels. In: Clinically Applied Microcirculation Research. 32, 435-456 (1995).
- Lombard, J. H., Liu, Y., Fredricks, K. T., Bizub, D. M., Roman, R. J., Rusch, N. J. Electrical and mechanical responses of rat middle cerebral arterieal to reduced PO2 and prostacyclin. Am. J. Physiol. 276, H509-H516 (1994).
