Summary
中脑多巴胺系统及纹状体植为胶原基质检测
Abstract
中脑多巴胺（mdDA）神经元的项目，通过对几个领域，在端脑，包括纹状体内侧前脑束。同样地，中等刺在纹状体的神经元，引起纹状体黑（直接）通路支配黑质2。的这些轴突大片的发展是依赖过多的轴突生长和指导线索，包括由突起或释放（中间）目标地区3,4分子组合行动。这些可溶性因子可以在体外研究的培养mdDA和/或在胶原基质，它提供了一个立体的模仿外环境的轴突基板纹状体植。此外，胶原基质允许放置在附近（例如，见参考文献5和6）其他植或细胞蛋白形成相对稳定的梯度。在这里，我们描述的PUR的方法ification的鼠尾胶原蛋白，多巴胺和纹状体外植体的显微切割，他们的文化，在胶原蛋白凝胶和随后的免疫组化和定量分析。首先，E14.5小鼠胚胎的大脑是孤立和多巴胺和显微纹状体植。这些植（CO）盖玻片上培养48至72小时在体外在胶原凝胶。随后，轴突的预测是使用可视化的神经标记（如酪氨酸羟化酶，DARPP32，或βIII微管蛋白）和轴突生长和吸引力或排斥力的轴突反应进行量化。这神经的编制是一项有用的工具， 在的mesostriatal与纹状体黑轴突生长和发育过程中的指导体外培养的细胞和分子机制研究。采用此法，它也有可能评估其他（中级）多巴胺和纹状体轴突的目标，或测试特定的分子线索。
Protocol
1。鼠尾胶原的制备
- 收集6-10成年鼠尾（这是可能的尾巴，直到使用储存在-20°C）。
- 隔夜浸泡在95％乙醇的尾巴在室温（RT）。
解剖老鼠尾巴（组织培养罩）：
（保持在70％乙醇的工具时，不使用他们，并确保在整个过程中使用的所有解决方案，工具和玻璃器皿是无菌）
- 收集从尾巴肌腱，切断尾巴尖。同一个钳子的大尾巴结束。用另一个钳子举行，弯曲和折断尾部接近其他镊子。拉开和肌腱会被留下（ 图1A，B）的。
- 收集在无菌的H 2 O的肌腱和收集所有筋后用无菌的H 2 O移动到一个新的petridish
- 服用2-3筋，切丝用2对为CEPS在一个无菌的H 2 O的新petridish删除非肌腱组织，如静脉（肌腱组织是有光泽和反射图1C）。拆除所有非肌腱组织后，每尾产生约100-150毫克的肌腱。
- 肌腱转移300毫升无菌的3％醋酸和隔夜慢慢搅拌4°C。
- 添加额外的200毫升无菌的3％醋酸，搅拌慢慢一夜之间在4°C。
- 离心机的醋酸溶液中，包含120分钟，4〜2700 XG筋°C间沉淀不溶解的肌腱和非肌腱组织。
- 准备在离心透析管：
- 切件40厘米
- 5分钟烧开500μMEDTA
- 无菌Ĥ2 O的凉爽
- 在透析管的一端绑一个结，并填写用上清液离心肌腱解决方案，在组织文化引擎盖冰的油管使用自动pipettE和25毫升吸管。避免产生气泡。结无菌铝箔冰商店的油管和油管的另一端，直到所有管件填补（ 图1D）。
- 准备在组织文化引擎盖10无菌0.1X MEM，pH值4.0升。浮子管件和添加这些预冷0.1X的MEM溶液10升烧杯。透析在4°C，而在一夜之间慢慢搅拌。此透析除去多余的酸性物质，同时保持低的pH值。
- 更换新的预冷10升0.1X的MEM搅拌一夜之间在4°C。
- 更换新的预冷10升0.1X的MEM，重复上一步搅拌一夜之间在4°C。
- 分装到无菌的50毫升管的胶原溶液。在4°C店等分保持6-12个月，仅处理在组织文化引擎盖的胶原股票。
- 重要的是要测试是否需要稀释纯化的胶原质（0.1X的MEM）胶原MATR获得最佳效果第九检测。因此，产生胶原蛋白系列稀释（稀释的胶原蛋白，1:1，1:2和1:5稀释），并执行如下所述，以确定最佳的胶原蛋白稀释胶原基质检测。
2。多巴胺中脑的解剖7,8
- 从母亲的子宫解剖E14.5小鼠胚胎和L15培养基上冰，直到需要。
所有后续的解剖步骤进行在L15介质上冰。
- 剖析了大脑。
- 取出切割沿内侧部分每端脑泡（为纹状体植使用的端脑泡）的前脑。
- 取出脑膜护套。
- 使背腹切只是脑弯曲的喙。
- 再拍背腹切只是脑曲尾。
- 使用1 microdissectio使沿背中线rostrocaudal切列印刀，露出底层的腹侧中脑组织。小心打腹侧脑组织，因为它包含的多巴胺能神经元（ 图2）。
- 使两个rostrocaudal削减横向和腹侧中线平行，消除背部的脑组织。
- 其余腹侧脑组织分为植用显微切割刀。
- 存储在L15冰，直到使用含有5％胎牛血清培养基外植体。
3。纹状体的剖析
所有的解剖步骤进行在L15介质上冰。
- 使用端脑泡在脑解剖解剖。
- 取下丘脑，在丘脑和纹状体使用镊子之间的切割。
- 1正中侧面切喙纹状体删除，如嗅球延髓结构。位于尾端纹状体组织重复此步骤。
- 位置其余切片获得的纹状体冠状（ 图2）。
- 纹状体可以确认，作为一个组织的密度较小（更加透明）的一部分。到外植体，用显微切割刀解剖纹状体和切割。避免中线稍深组织紧密，其中包含神经细胞迁移的外侧和内侧的神经节隆起。
- 存储在L15冰，直到使用含有5％胎牛血清培养基外植体。
4。大会胶原基质的检测
胶原蛋白的制备（上冰的所有步骤，使用冷却枪头）
- 100μL的MEM 10倍和40微升1M碳酸氢钠（ 碳酸氢钠 ）混合860μL稀释后的胶原蛋白和保持在冰上。如果在这一点上的胶原蛋白升温，这将巩固。
- 在4以及NUNC菜以及准备胶原（直径约5毫米）下降了20μL添加到盖玻片并让它在二氧化碳培养箱站在37°C和5％的CO 2为30分钟（环境氧浓度就足够了）。在此孵化的胶原蛋白会涂胶。
设置共培养在胶原蛋白凝胶
- 胶原蛋白已糊化后，用200μl的尖端吸管传输多巴胺或纹状体植的胶原蛋白。
- 移动在接近使用针彼此的外植体。让他们除了在距离约直径一植（200-300微米）（ 图2）。
- 去除多余的介质，并加入20微升外植体上制备的胶原。这往往会导致植走动。定位用针如4.4中所述的外植体。
- 让胶原在室温下15分钟固化，30分钟之后，在37°C和5％CO 2。
- 胶原成立后，加入400μL电子xplant中期和增长为2-3天，在二氧化碳培养箱37℃，5％CO 2。
5。通过免疫组化和定量分析
免疫组化
- 要解决植，轻轻在PBS中添加8％多聚甲醛400μL（PFA）培养基400μL（从而稀释至4％的煤灰）和静置在室温下为1小时。
- 在室温下洗3倍的PBS 15分钟。
- 阻止缓冲区（BB孵化; PBS + 1％FBS + 0.1％的Triton X-100）2小时。
- 在4°C孵育过夜BB抗体对于多巴胺神经轴突使用的抗酪氨酸羟化酶抗体（1:1000）7，反DARPP32抗体（1:500）9纹状体轴突和可视化所有轴突反βIII微管蛋白（1:3000）7。
- 在室温下在PBS洗5倍1小时。
- 4 BB（1:500）在适当的荧光标记的第二抗体，孵育过夜°C。从这个步骤，尽量减少外植体暴露在光线（例如覆盖铝箔）。
- 在PBS洗一夜之间在4°C间在第二天洗。
- 安装在显微镜植幻灯片使用延长抗淬灭试剂安装介质。添加玻璃显微镜幻灯片〜10微升下降。盖玻片，轻轻地放在植朝下安装介质下降。避免捕获的盖玻片下的空气非常轻轻地降低它的安装介质下降。
量化计算的P / D比值
- 使用萤光显微镜的外植体（ 图3）获得数字图像。
- 使用这些图像，每个象限分为外植体产生近端象限（即最接近相邻植植）和远端象限（最远从相邻expla远离外植体的一部分NT），4（图2）。
- 测量在近端和远端象限植20最长的新兴突起的长度。
- 使用20最长突起的平均长度来计算的P / D比值为每个个别的外植体。美联社/ D比值> 1表明轴突的吸引力，而比<1表示轴突的排斥。
- 在某些情况下，密集的突起生长，防止个别突起长度的评估。在这种情况下，量化可以通过测量外植体的优势和领先的前轴突生长在近端和远端象限之间的距离。
6。代表性的图像
多巴胺和纹状体植培养成功后的轴突大量使用明场显微镜可见或可视作为反βIII的微管蛋白的免疫细胞化学（未显示）。这些轴突的一个子集，将多巴胺或S作为可视化用免疫细胞化学triatal轴突（ 图3）。由外植体划分成象限描述和确定的P / D比值，假定轴突的吸引或排斥效果可量化的（ 图3E）。
图1。照片说明从鼠尾肌腱胶原蛋白的制备。拉除鼠尾）公开筋。乙）筋绳状束可见。 c）筋容易从静脉区分他们闪亮的白色外观。 d）溶解在乙酸筋后，将溶液转移至透析管。要保持胶原蛋白溶解冷，管放置在冰上的无菌铝箔。
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图2显示该程序的不同步骤。示意图。适当的大脑区域的解剖和削减产生植。一个单一的脑和纹状体植在胶原基质放置在靠近，离开增长为48-72小时，在37°C轴突荧光免疫组化，可视化和计算的P / D比值量化chemotropic反应。
图3。代表结果显示轴突生长在胶原基质的文化。一）中脑外植体染色与抗酪氨酸羟化酶抗体揭示轴突生长。虚线表示相邻的外植体。乙类）放大显示个人轴突和生长锥（箭头）。三）纹状体植沾满反DARPP32的。 d）C的放大显示个别突起。 é）为例，的P / D比值量化。外植体分为相等象限。近端象限正面临着相邻的外植体，而远端象限正面临着远离它。规模横道100微米。
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Discussion
这里描述的胶原基质试验已在过去的几十年里许多不同的实验室使用和改进探讨轴突导向分子和神经系统的各种（例如，见参考文献5-8）。这些研究表明，这种试验是研究轴突导向分子不同（中级）靶组织分泌的影响和调控的有力工具。
然而，应当指出，胶原基质是外环境（ECM）的替代品，但显然缺乏通常在ECM目前许多蛋白质。 ECM的组件被称为影响轴突导向分子10的影响。然而，胶原基质试验是调查在体外和其他的组织培养方法（如器官切片文化11）或基因工程动物模型的分析相结合的基本分子机制尤其有用。 有几个因素决定的胶原基质试验成功。首先，外植体的大小，是最佳的轴突生长的关键。大量的多巴胺和纹状体植往往显示有限的轴突生长，而小植表明不规则和fasciculated的的产物。此外，个别外植体之间的距离大大影响分泌的分子可以发挥在相邻的外植体的影响。如果植是相距甚远，扩散分子将无法达到的外植体。反之，当距离过小的轴突可能增长到相邻的外植体，难以定性和定量评估轴突生长和指导。最后，鼠尾胶原蛋白的质量是重要的，与轴突的生长和生存的外植体直接相关。
这里描述的检测，可以进行修改，以不同的方式来解决具体的研究问题。例如，除了（候选人）分子的功能抑制功能的阻断抗体的生长介质允许。此外，外植体可以结合细胞聚集分泌特定轴突生长和指导因素。最后，外植体可以得到从GFP的记者，在特定的神经元的人口和他们的轴突标记的小鼠。使用此设置，轴突可以在胶原基质试验过程中应遵循。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
胶原基质试验已制定和完善了许多不同的研究小组在过去的二，三十年的工作。多巴胺和纹状体植这里描述的方法，从这些研究中大大受益。此外，要感谢她的帮助下设立纹状体植文化Asheeta普拉萨德。在实验室工作是由人类前沿科学计划组织（职业发展奖），荷兰健康研究与发展组织（ZonMW VIDI和弦ZonMW），Europanian联盟（mdDA NeuroDev，FP7/2007-2011的格兰特222999）（RJP），荷兰科学研究组织（TopTalent; ERES）时。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA Laboratories | M11-004 | |
| Hepes | VWR international | 441476L | |
| β-Mercapt–thanol | Merck & Co., Inc. | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 61100-087 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
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