Summary
Explantaten de dopaminesysteem en striatum worden gebruikt in een collageenmatrix test voor het
Abstract
Dopaminesysteem (mdDA) neuronen project via de mediale voorhersenen bundel naar verschillende gebieden in de grote hersenen, waaronder het striatum 1. Omgekeerd, medium stekelige neuronen in het striatum die aanleiding geven tot de striatonigrale (directe) route innerveren de substantia nigra 2. De ontwikkeling van deze axon stukken is afhankelijk van de combinatorische acties van een overvloed aan axon groei en begeleiding signalen met inbegrip van moleculen die zijn vrijgegeven door neurieten of door (tussen) doel de regio's 3,4. Deze oplosbare factoren kunnen worden bestudeerd in vitro door het kweken mdDA en / of striatum explantaten een collageenmatrix met een driedimensionale substraat voor het nabootsen axons de extracellulaire omgeving zorgt. Bovendien is de collageenmatrix maakt de vorming van relatief stabiele gradiënten van eiwitten vrijgegeven door andere explantaten of cellen die in de nabijheid (zie bijvoorbeeld referenties 5 en 6). Hier beschrijven werkwijzen voor het purultieme controle van rattenstaart collageen, microdissectie van dopaminerge en het striatum explantaten, hun cultuur in collageen gels en de daarop volgende immunohistochemische en kwantitatieve analyse. Ten eerste, de hersenen van E14.5 muizenembryo's zijn geïsoleerd en dopaminerge en het striatum explantaten zijn gemicrodissecteerde. Deze explantaten worden vervolgens (co) gekweekt in collageengels op dekglaasjes 48 tot 72 uur in vitro. Vervolgens axonale projecties zijn gevisualiseerd met behulp van neuronale markers (bijvoorbeeld tyrosine hydroxylase, DARPP32 of βIII tubuline) en axongroei en aantrekkelijke of afstotende axon antwoorden worden gekwantificeerd. Deze neuronale voorbereiding is een handig hulpmiddel voor in vitro studies van de cellulaire en moleculaire mechanismen van mesostriatal en striatonigrale axongroei en begeleiding tijdens de ontwikkeling. Met deze assay, is het ook mogelijk om andere (tussen) doelen voor dopaminerge en striatum axonen beoordelen of specifieke moleculaire signalen testen.
Protocol
1. Voorbereiding van de Rat Tail Collageen
- Verzamelen 6-10 volwassen rat staart (het is mogelijk om de staart bewaren bij -20 ° C tot gebruik).
- Laat de staarten in 95% ethanol gedurende de nacht bij kamertemperatuur (RT).
Dissectie van de rat staarten (in weefselkweek kap):
(Houd tools in 70% ethanol als u niet met hen en zorg ervoor dat alle oplossingen, tools en glaswerk tijdens de gehele procedure steriel zijn)
- Om pezen te halen bij de staart, afgesneden het puntje van de staart. Houd brede uiteinde van de staart met een pincet. Gebruik een andere tang te houden, buigen en de staart in de buurt van de andere tang te breken. Trek uit elkaar en de pezen zullen achtergelaten worden (Figuur 1A, B).
- Verzamel de pezen in steriele H 2 O en na het verzamelen van alle pezen verplaats ze naar een nieuwe petrischaal met steriele H 2 O.
- Neem 2-3 pezen en rasp ze met behulp van 2 paar vooreekhoorntjesbrood in een nieuwe petrischaal met steriele H 2 O. Verwijder de niet-peesweefsel, zoals aderen (peesweefsel is glanzend en reflecterende; Figuur 1C). Na het verwijderen van alle niet-peesweefsel, elke staart levert ongeveer 100-150 mg van pezen.
- Breng de pezen 300 ml steriele 3% azijnzuur en roeren langzaam overnacht bij 4 ° C.
- Een extra 200 ml steriele 3% azijnzuur en roeren langzaam overnacht bij 4 ° C.
- Centrifugeer de azijnzuuroplossing die de pezen ~ 2700 g gedurende 120 minuten bij 4 ° C tot pellet niet-opgeloste pezen en niet peesweefsel.
- Tijdens centrifugeren bereiden dialysebuis:
- gesneden stukken van 40 cm
- koken in 500 uM EDTA gedurende 5 min
- koel in de steriele H 2 O
- Leg een knoop in een uiteinde van de dialysebuis en vullen de buis met het supernatant van de gecentrifugeerde pees oplossing op ijs in weefselkweek kap met behulp van een automatische pipette en een 25 ml pipet. Vermijd het produceren van bubbels. Knoop het andere einde van de slang en opslaan buis van steriele aluminiumfolie op ijs tot alle buisstukken gevuld (figuur 1D).
- Bereid 10 l van de steriele 0,1 x MEM, pH 4,0, in de weefselkweek kap. Voeg floater om stukken van de slang en voeg deze aan de pre-gekoelde 0,1 x MEM oplossing in een 10 l beker. Dialyze nacht bij 4 ° C onder langzaam roeren. Deze dialyse verwijdert overtollige zuur terwijl de pH-waarde laag is.
- Plaats een nieuwe pre-gekoelde 10 l 0,1 x MEM en roer overnacht bij 4 ° C.
- Herhaal de vorige stap door het vervangen met een nieuwe pre-cooled 10 l 0,1 x MEM en roer overnacht bij 4 ° C.
- Aliquot collageenoplossing in steriele 50 ml. Winkel aliquots bij 4 ° C. Houd 6-12 maanden, alleen omgaan met het collageen voorraad in de weefselkweek kap.
- Het is belangrijk om te testen of de gezuiverd collageen moet worden verdund (in 0,1 X MEM) om optimale resultaten te verkrijgen in het collageen matrix assay. Daarom is het genereren van een collageen verdunningsreeks (onverdund collageen, 1:1, 1:2 en 1:5 verdund) en het uitvoeren van collageen matrix assays zoals hieronder beschreven om de optimale collageen verdunning te bepalen.
2. Dissectie van de dopaminerge middenhersenen 7,8
- Ontleden E14.5 muis embryo's uit de baarmoeder van de moeder en houden L15 medium op ijs totdat het nodig is.
Alle volgende sectie stappen uitgevoerd in L15 medium op ijs.
- Ontleden van de hersenen.
- Verwijder de grote hersenen door te snijden langs de mediale deel van elk telencephalic blaasje (gebruik de telencephalic blaasjes voor striatale explantaten).
- Verwijder de meningeale schede.
- Maak een dorsoventral cut net rostraal van de mesencephalic buiging.
- Maak nog een dorsoventral cut net caudaal van de mesencephalic buiging.
- Maak een rostrocaudal snede langs de dorsale middellijn met een microdissection mes om de onderliggende ventrale middenhersenen weefsel bloot te leggen. Wees voorzichtig dat u de ventrale middenhersenen weefsel raken, want het bevat de dopaminerge neuronen (figuur 2).
- Maak twee rostrocaudal sneden laterale en parallel aan de ventrale middellijn aan dorsale middenhersenen weefsel te verwijderen.
- Verdeel de resterende ventrale middenhersenen weefsel in explantaten met een microdissectie mes.
- Bewaar de explantaten in L15 medium bevattende 5% FBS op ijs tot gebruik.
3. Dissectie van het striatum
Alle ontleding stappen uitgevoerd in L15 medium op ijs.
- Gebruik telencephalic blaasjes ontleed tijdens de middenhersenen dissectie.
- Verwijder de thalamus door te snijden tussen de thalamus en het striatum behulp van een tang.
- Maak een mediolaterale snede rostraal van de striatum te rostrale structuren te verwijderen, zoals de bulbus olfactorius. Herhaal deze stap voor weefsel caudaal gelegen aan het striatum.
- Positiede resterende segment naar een transversale weergave van het striatum verkrijgen (Figuur 2).
- De striatum kunnen worden herkend als een minder dicht (meer transparant) van weefsel. Ontleden van het striatum en snijd deze in explantaten met een microdissectie mes. Vermijd de iets donkerder weefsel in de buurt van de middellijn, die migratie van neuronen van de laterale en mediale ganglion eminentie bevat.
- Bewaar de explantaten in L15 medium bevattende 5% FBS op ijs tot gebruik.
4. Vergadering Collageen Matrix Assays
Voorbereiding van het collageen (alle stappen op het ijs, gebruik gekoeld pipetpunten)
- Meng 860 pi verdund collageen met 100 ul 10x MEM en 40 ul 1 M natrium (NaHCO 3) te houden op ijs. Als op dit punt het collageen opwarmt, zal stollen.
- Voeg een druppel 20 ul (ongeveer 5 mm diameter) bereide collageen een dekglaasje in een putje van een 4-well Nunc schotelen laat in een CO2 incubator staan bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 30 min (omgevingstemperatuur O 2 concentratie voldoende). Tijdens deze incubatie de collageen verstijfselen.
Setup co-cultuur in collageen-gel
- Na het collageen is ontsloten, gebruik dan een pipet met een 200 ul tip om een dopaminerge of striatale explant over te dragen aan het collageen.
- Verplaats de explantaten dicht bij elkaar met behulp van een naald. Elkaar gehouden kunnen op een afstand van ongeveer de diameter van een explantaat (~ 200-300 urn) (Figuur 2).
- Overtollig medium en voeg 20 pl bereid collageen bovenop de explantaten. Dit zal veroorzaken vaak explantaten te bewegen. Plaats de explantaten behulp van een naald, zoals beschreven in 4.4.
- Laat de collageen stollen gedurende 15 minuten bij RT gevolgd door 30 min bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na het collageen heeft, voeg 400 ul van explant medium en 2-3 dagen in een CO2 incubator bij 37 ° C groeien en 5% CO2.
5. Analyse door immunohistochemie en kwantificering
Immunohistochemie
- Om explantaten vast voorzichtig toevoegen 400 ul 8% paraformaldehyde (PFA) in PBS 400 ul medium (waarbij verdunning van het PFA 4%) en laten staan gedurende 1 uur bij RT.
- Was 3x 15 min in PBS bij KT.
- Incubeer in blokkeringsbuffer (BB, PBS + 1% FBS + 0,1% Triton X-100) gedurende 2 uur.
- Incubeer 's nachts met primaire antilichaam in BB bij 4 ° C. Voor dopaminerge axonen gebruik van anti-tyrosine hydroxylase antilichamen (1:1000) 7, voor het striatum axonen anti-DARPP32 antilichamen (1:500) 9 en voor het visualiseren van alle axonen anti-βIII tubuline (1:3000) 7.
- Was 5x 1 uur in PBS bij RT.
- 'S nachts Incubeer met secundaire antilichaam geconjugeerd aan het juiste fluorofoor (1:500) in BB op 4° C. Vanaf deze stap op het risico op blootstelling van de explantaten voor licht (bijv. ze te bedekken met aluminiumfolie).
- Was nacht in PBS bij 4 ° C gevolgd door verschillende wassen tijdens de volgende dag.
- Monteer explantaten op objectglaasjes met Verleng Antifade reagens montage medium. Voeg een druppel ~ 10 pi van een microscoopglaasje. Neem de dekglaasje en voorzichtig te plaatsen op de daling van montage medium met de explant kant naar beneden. Vermijd het vangen van alle lucht onder de dekglaasje door zeer voorzichtig verlagen van het op de daling van de montage-medium.
Kwantificering door het berekenen van P / D-verhouding
- Verwerven digitale beelden van de explantaten met een epifluorescentiemicroscoop (figuur 3).
- Met deze beelden verdelen elke explantaat in kwadranten met een proximaal kwadrant (dat wil zeggen van het explantaat dichtst bij de aangrenzende explantaat) en een distaal kwadrant (deel van het explantaat verst van de aangrenzende toelichting genererennt) (Figuur 2, 4).
- Meet de lengte van 20 langste neurieten die uit het explantaat zowel de proximale en distale kwadranten.
- Gebruik de gemiddelde lengte van de 20 langste neurieten naar de P / D ratio te berekenen voor elke individuele explant. AP / D ratio> 1 geeft aan axon attractie, terwijl een ratio <1 duidt axon afstoting.
- In sommige gevallen de dichte groei van neurieten voorkomt de beoordeling van afzonderlijke neurite lengte. In deze gevallen kan kwantificering uitgevoerd door de afstand tussen de rand van het explantaat en de leidende voorkant van axongroei in de proximale en distale kwadranten.
6. Afbeeldingen slechts ter illustratie
Na een succesvolle cultuur van dopaminerge en het striatum explantaten een groot aantal axonen zijn zichtbaar met behulp van helder veld microscopie of gevisualiseerd door anti-βIII tubuline immunocytochemie (niet afgebeeld). Een subset van deze axonen zijn dopaminerge of s triatal axonen als gevisualiseerd met behulp van immunocytochemie (figuur 3). Door het verdelen van de explantaten in kwadranten zoals beschreven en het bepalen van P / D ratio's, kan een vermeende axon aantrekkelijke of afstotende effect gekwantificeerd worden (figuur 3E).
Figuur 1. Foto's ter illustratie van de vervaardiging van collageen uit rattenstaart pezen. A) uit elkaar trekken van de rattenstaart onthult de pezen. B) Pezen zijn zichtbaar als touw-achtige bundels. C) De pezen zijn gemakkelijk te uit aderen onderscheiden door hun glanzend witte verschijning. D) Na oplossen van de pezen in azijnzuur wordt de oplossing overgebracht naar dialysebuis. Om de opgeloste collageen koud te houden, worden buisjes geplaatst op steriele aluminiumfolie op ijs.
e 2 "src =" / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg "/>
Figuur 2. Schematische aanduiding van de verschillende stappen van de procedure. Geschikte gebieden van de hersenen worden ontleed en gesneden explantaten te genereren. Een middenhersenen en striatum explantaat gepositioneerd in de nabijheid van een collageenmatrix en liet men gedurende 48-72 uur kweken bij 37 ° C. Axonen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentie immunohistochemie en een P / D-ratio wordt berekend aan chemotropic reacties te kwantificeren.
Figuur 3. Vertegenwoordiger resultaten laten zien axon groei in een collageen matrix cultuur. A) middenhersenen explant gekleurd met anti-tyrosine hydroxylase antilichaam onthullen axon uitgroei. Gestippelde lijn geeft aangrenzende explant. B) vergroting van een met individuele neurieten en groei kegels (pijlen). C) striatale explant gekleurd met anti-DARPP32. D) Vergroting van C met individuele neurieten. E) VoorbeeldP / D-verhouding kwantificering. Explantaten zijn in gelijke kwadranten. Het proximale kwadrant wordt naar de aangrenzende explantaat terwijl het distale kwadrant is afgelegen gericht. Schaal balken geven de 100 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De matrix van collageen-test hier beschreven is gebruikt en verbeterd door veel verschillende laboratoria in de afgelopen decennia aan een verscheidenheid van axon begeleiding moleculen en neuronale systemen te onderzoeken (zie bijvoorbeeld referenties 5-8). Deze studies hebben aangetoond dat deze test is een krachtig instrument voor het bestuderen van de effecten en de regulatie van axon begeleiding moleculen die afgescheiden wordt door verschillende (tussen) doel weefsels.
Er moet echter worden opgemerkt dat de collageenmatrix is een alternatief voor de extracellulaire omgeving (ECM), maar duidelijk mist veel eiwitten normaal in de ECM. Onderdelen van de ECM bekend om de effecten van axon leiding moleculen 10 beïnvloeden. Niettemin de collageenmatrix assay is bijzonder nuttig voor het onderzoeken fundamentele moleculaire mechanismen in vitro en in combinatie met andere weefselkweek stappen (bijvoorbeeld organotypische slice culturen 11) of de analyse van genetisch diermodellen. Verschillende factoren bepalen het succes van de collageen matrix test. Ten eerste is de grootte van de explantaten cruciaal is voor optimale axongroei. Grote dopaminerge en het striatum explantaten vertonen vaak een beperkte axon groei, terwijl kleine explantaten tonen onregelmatig en fasciculated uitgroei. Bovendien is de afstand tussen de explantaten grote invloed op de werking een uitgescheiden molecule kan uitoefenen op aangrenzende explantaten. Als de explantaten te ver uit elkaar, zal diffundeerbare moleculen niet aan de explantaten te bereiken. Omgekeerd, als de afstand te klein is axonen kunnen uitgroeien tot de aangrenzende explantaten, waardoor het moeilijk is om kwalitatief en kwantitatief te beoordelen axongroei en begeleiding. Tenslotte is de kwaliteit van de rattenstaart collageen is belangrijk en is direct gecorreleerd met de uitgroei van axonen en overleving van explantaten.
De test hier beschreven kan worden aangepast op verschillende manieren om specifieke onderzoeksvragen aan te pakken. Zo toevoeging vanfunctie blokkerende antilichamen tegen het groeimedium kan de functionele remming van (kandidaat) moleculen. Bovendien kan explantaten worden gecombineerd met celaggregaten afscheidende specifieke axongroei en leiding factoren. Tot slot zou explantaten worden verkregen van GFP reporter muizen waarin specifieke neuronale populaties en hun axonen zijn gelabeld. Met behulp van deze opstelling, kan axonen worden gevolgd in de loop van de collageen matrix test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De matrix van collageen test is ontwikkeld en verbeterd door het werk van vele verschillende onderzoeksgroepen de afgelopen twee tot drie decennia. De aanpak hier beschreven voor de dopaminerge en het striatum explantaten veel baat hebben bij deze studies. Daarnaast zou de auteurs willen Asheeta Prasad bedanken voor haar hulp bij het opzetten van striatale explant culturen. Werk in het lab werd gefinancierd door het Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award), Nederland Organisatie van gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMw-VIDI-en ZonMW-TOP), de Europanian Unie (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222999) (in RJP), en Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (Toptalent, tot ERES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA Laboratories | M11-004 | |
| Hepes | VWR international | 441476L | |
| β-Mercapt–thanol | Merck & Co., Inc. | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 61100-087 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J.
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J.
- Chilton, J. K.
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
