Los recientes avances en microscopía de dos fotones han permitido en tiempo real<em> En</em> Imágenes in situ de los tejidos vivos en modelos animales, lo que mejora nuestra capacidad para investigar el comportamiento celular, tanto en condiciones fisiológicas y patológicas. Aquí, se exponen los trabajos preparatorios necesarios para realizar las imágenes intravital del nodo linfático poplíteo del ratón.
Los ganglios linfáticos (LNS) son los órganos linfoides secundarios, los cuales están estratégicamente ubicadas en todo el cuerpo para permitir la captura y presentación de antígenos extraños de los tejidos periféricos a la animación de la respuesta inmune adaptativa. Yuxtapuesta entre la respuesta inmune innata y adaptativa, la LN es un sitio ideal para estudiar las interacciones de las células inmunitarias 1,2. Los linfocitos (células T, células B y células NK), las células dendríticas (DC) y los macrófagos constituyen el grueso de la médula ósea derivados de los elementos celulares de la LN. Estas células se colocan estratégicamente en la LN que permita un control eficiente de los antígenos propios y el potencial de antígenos extraños 3-5. El proceso por el cual los linfocitos encuentran antígenos afines con éxito es un tema de intensa investigación en los últimos años, y consiste en una integración de los contactos moleculares, incluyendo receptores de antígenos, moléculas de adhesión, quimiocinas, y las estructuras del estroma, como la red de fibro-reticular 2,6-12 . </p>
Antes del desarrollo de la alta resolución en tiempo real fluorescente de imágenes in vivo, los investigadores se basaron en las imágenes estáticas, que sólo ofrece respuestas sobre la morfología, la posición y la arquitectura. Si bien estas preguntas son fundamentales en nuestra comprensión del comportamiento de las células inmunitarias, las limitaciones intrínsecas de esta técnica no permite un análisis para descifrar el tráfico de linfocitos y pistas ambientales que afectan el comportamiento celular dinámico. Recientemente, el desarrollo de intravital microscopía de dos fotones del láser de barrido (2P-LSM) ha permitido a los investigadores ver los movimientos dinámicos y las interacciones de las células individuales dentro de LN en directo in situ 12-16. En particular, y otros han aplicado esta técnica para el comportamiento de la imagen celular y las interacciones dentro de la poplítea LN, donde su naturaleza compacta, densa ofrece la ventaja de múltiplex de adquisición de datos sobre un área grande del tejido con diversos tejidos sub-estructuras 11,17-18 . Se is importante señalar que esta técnica ofrece beneficios adicionales más explantados técnicas de tejido de imágenes, que requieren la interrupción de la sangre, el flujo de la linfa, y en última instancia, la dinámica celular del sistema. Además, los tejidos explantados tener una ventana de tiempo muy limitado en el que el tejido permanece viable para las imágenes después del explante. Con una hidratación adecuada y el seguimiento de las condiciones ambientales de los animales, el tiempo de formación de imágenes puede ser ampliado considerablemente con esta técnica intravital. A continuación, presentamos un método detallado de la preparación del ratón LN poplítea con el fin de realizar imágenes intravital.
Los avances recientes en alta resolución de las técnicas de imagen in situ, especialmente 2P-LSM, se han acompañado de un creciente interés en el estudio del comportamiento dinámico celular di vivo. La técnica de imagen 4D en la LN poplíteo de un ratón vivo permite este tipo de análisis en el comportamiento dinámico de las células inmunes en el tejido ininterrumpido de micro-medio ambiente. El uso de 2P-LSM con detectores múltiples que abarcan todo el espectro visible permite imágenes simultáneas de recopilación de datos de poblaciones de células múltiples. Esto ahora puede lograrse mediante la utilización in vivo de células específicas de ratones reportero fluorescentes (por ejemplo ubiquitina-eGFP, PP, o ECFP-) combinados con el uso de la transferencia adoptiva de poblaciones de células marcadas diferencialmente utilizando colorantes orgánicos de células fluorescentes (por ejemplo CFSE , SNARF-1, y la célula Rastreador de Orange) para examinar los mecanismos celulares y la función dentro de la LN. Además de la observación directa de las interacciones entre diferencialmente rastreados clas poblaciones de ell, el conjunto de datos de imagen múltiple pueden someterse a un nuevo análisis con imágenes de los programas disponibles en el mercado de software de procesamiento (por ejemplo, Imaris, Bitplane Inc.) Para aclarar aún más el comportamiento y la función celular. Una amplia gama de posibilidades que existe para estudiar los mecanismos celulares de interacción que utilizan estos in vivo e di silico técnicas.
La principal limitación del método experimental descrito aquí es la complejidad técnica inherente en el enfoque de la cirugía. Esta técnica requiere de un riguroso entrenamiento para familiarizarse con la anatomía pertinente y los procedimientos específicos y destrezas técnicas que requiere este protocolo. Para complicar aún más factores incluyen la dificultad para reducir al mínimo el daño tisular durante la exploración LN, la optimización de la estabilidad de los tejidos durante la exploración, y la prevención de lesiones térmicas y láser a la LN, antes y durante la experimentación de imágenes. Perturbación a cualquiera de estos factores dará lugar a menos que óptimo linfáticola motilidad ocyte y por lo tanto va a interferir con la correcta interpretación de los datos resultantes de imagen análisis.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo es apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer 1R01CA154656, el NIAID 1R21AI092299, Instituto de Investigación del Cáncer, la Fundación San Baldrick, la Fundación Dana, la Fundación Ángel de Gabrielle, y Hyundai Motors de América "La esperanza-on-Wheels" del programa.
Reagent | Company | Catalogue Number |
Isoflurane, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-773-60 |
Vetbond | 3M | 1469SB |
Nair – hair removal lotion | Nair | |
PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV |
Heating pad | Watlow | |
Heating Pad Controller | Watlow | |
Air and O2 | Airgas | |
Temperature probe | Harvard Apparatus | |
Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc | 14101 |
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc | 14141 |
Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5880 |
Cover of 100×20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 |
Cover of 100×20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 |
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-150-08 |