में मरीजों Haematological द्रोह इनवेसिव फेफड़े Aspergillosis है की पार्श्व - प्रवाह प्रौद्योगिकी का उपयोग करके जांच

Summary

इनवेसिव फेफड़े aspergillosis के लिए एक तेजी से और सही परीक्षण बिंदु की देखभाल प्रस्तुत किया है. यह पार्श्व प्रवाह प्रौद्योगिकी का लाभ लेता है एक विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है कि एक बांध का उपयोग<em> Aspergillus</em> प्रतिजन फेफड़े के संक्रमण के दौरान secreted है. परख सीरम और brochoalveolar पानी से धोना के साथ संगत है और रोग निदान के लिए एक उपन्यास सहायक परीक्षण का प्रतिनिधित्व करता है.

Abstract

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients¹. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a ‘gold standard’, relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining “proven”, “probable”, and “possible” invasive fungal diseases². Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.

Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens³, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.

An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a ‘pan-fungal’ assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 →3)-β-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls^1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests^1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection^1,5.

Thornton⁵ recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only⁵. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 → 3)-β-D-glucan assays⁷.

Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

Protocol

1. संग्रह, संग्रहण, और सीरम और ब्रोन्कोएल्वियोलर Lavage तरल पदार्थ की तैयारी अनुपचारित रक्त के नमूने से रक्त थक्का करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, और -20 पर aliquots के रूप में दुकान सीरम डिग्री सेल्सियस उपयोग करने के लिए पूर्व अनुमति के द्वारा सीरम ले लीजिए. ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) तरल पदार्थ भी -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots के रूप में संग्रहित किया जाना चाहिए नोट: का भंडारण सीरम और बाल के रूप में aliquots नमूनों की फिर से परीक्षण के दौरान दोहराया फ्रीज विगलन द्वारा लक्ष्य प्रतिजन की गिरावट के लिए संभावित सीमा. पिघलना नमूने और सीरम और बाल के नमूने और 14,000 rpm पर 1 मिनट के लिए vortexing अपकेंद्रित्र द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से. मानव सीरम नमूनों का नियमित परीक्षण के लिए, टिशू कल्चर माध्यम (TCM) के साथ पतला सीरम 01:01 (v / v). टीसीएम RPMI +१६४० मध्यम, 10% (v / v) भ्रूण बछड़ा सीरम, 200mm एल glutamine के समाधान के 1% (v / v), और संरक्षक के रूप में सोडियम azide (0.02% w / वी) के होते हैं. मध्यम अग्रिम में तैयार किया जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है. Dilut के 100 μl लागू करेंएड LFD सीरम. मानव बाल तरल पदार्थ के लिए, और पशु मॉडल से बाल तरल पदार्थ के लिए, LFD कोई पूर्व उपचार के साथ साफ नमूने के 100 μl, लागू होते हैं. पशु मॉडल से सीरम के लिए, सीरम 01:02 (v / v) पतला साथ खारा फॉस्फेट बफर 4% (w / v) युक्त EDTA, 3min के लिए उबलते पानी के स्नान, 14,000 rpm पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में गर्मी, और 100 लागू LFD डिवाइस के लिए स्वच्छ सतह पर तैरनेवाला के μl. 2. सीरम और बाल की पार्श्व – प्रवाह डिवाइस के लिए आवेदन कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) में पार्श्व प्रवाह उपकरणों की दुकान. इस तापमान पर, उपकरणों के 12 महीने के लिए स्थिर रहे हैं. उनके एक स्तर की सतह पर और पाउच जगह से उपकरणों निकालें. एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करना, इस उपकरण की रिहाई बंदरगाह पूर्व इलाज सीरम या स्वच्छ बाल नमूना के 100 μl लागू होते हैं. परख के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट, जो समय पर परीक्षण के परिणाम दर्ज किया जाना चाहिए के लिए चलाने के लिए अनुमति देते हैं. नोट: सेकंड के भीतर तरल पदार्थ से होगाएन में अवलोकन खिड़की में nitrocellulose झिल्ली के साथ केशिका कार्रवाई द्वारा विस्थापित करने के लिए. 3. रिकॉर्डिंग और व्याख्या LFD परिणाम LFD एक आंतरिक नियंत्रण रेखा (प्लास्टिक के आवास पर पत्र सी ने संकेत दिया) और एक परीक्षण लाइन पत्र टी के संकेत होते हैं. नियंत्रण रेखा हमेशा सीरम या BAL नमूना में Aspergillus प्रतिजन के बिना प्रकट करना चाहिए. इससे पता चलता है कि परख सही ढंग से चलाने की है. Aspergillus प्रतिजन सीरम या बाल नमूना में मौजूद है, परीक्षण लाइन नमूना आवेदन के 15min के भीतर भी दिखाई देगा. क्योंकि परीक्षण लाइन की तीव्रता नमूने में Aspergillus प्रतिजन मौजूद की राशि के लिए आनुपातिक है, परीक्षण लाइन है एक कमजोर सकारात्मक (+) के रूप में प्रकट हो सकते हैं, एक उदारवादी सकारात्मक (+) के रूप में या एक मजबूत सकारात्मक (+) . हालांकि, किसी भी सकारात्मक परीक्षण लाइन है, तीव्रता की परवाह किए बिना नमूने में Aspergillus प्रतिजन की उपस्थिति का संकेत होगा. वें मेंAspergillus प्रतिजन ई अभाव, नहीं परीक्षण लाइन दिखाई देते हैं, और परिणाम नकारात्मक रूप में दर्ज की गई है (-). 4. प्रतिनिधि परिणाम नकारात्मक, सकारात्मक कमजोर, मध्यम बाल और सीरम के नमूने के साथ सकारात्मक है, और मजबूत सकारात्मक LFD परिणाम के प्रतिनिधि उदाहरण चित्र 1 में दिखाया जाता है. प्रतिजन सकारात्मक LFD परीक्षण (कमजोर और मजबूत) या नकारात्मक LFD परीक्षण तीव्र myeloid लेकिमिया रोगियों (एएमएल) / EORTC MSG के नैदानिक ​​मानदंडों के अनुसार निदान से बाल तरल पदार्थ का उपयोग करने का परिणाम तालिका 1 में दिखाया जाता है. इसी नैदानिक ​​और mycological (galactomannan और संस्कृति), डेटा और Aspergillus – विशिष्ट पीसीआर सेंट Bartholomews अस्पताल में 8 विकसित प्रत्येक रोगी के लिए परीक्षण के परिणाम इस तालिका में शामिल हैं. रोग के निदान के मेजबान कारकों (neutropenia, corticosteroids का लंबे समय तक इस्तेमाल, अन्य मान्यता प्राप्त टी सेल immunos के साथ इलाज के आधार पर किया गया थाuppressants), नैदानिक ​​मानदंड और बाल के लिए जीएम (यहाँ एक जीएम सूचकांक 0.8> मूल्य के रूप में परिभाषित) धनात्मकता. 2002 / EORTC MSG 10 दिशानिर्देश, 12 रोगियों, 13 और 16 के तहत मेजबान कारकों और नैदानिक ​​मानदंड या जीएम धनात्मकता के आधार पर संभव 'आइए साथ का निदान किया गया. संशोधित (2008) / EORTC MSG 2 दिशानिर्देश, मेजबान कारकों और जीएम धनात्मकता अकेले या मेजबान कारकों और नैदानिक ​​अकेला मापदंड के अनुसार संभव इनवेसिव कवक संक्रमण का संकेत नहीं है जब तक नैदानिक ​​डेटा और कवक विज्ञान से सबूत क्रमशः समर्थन के साथ होगा. 6 रोगी मेजबान कारकों, बड़ी और छोटी नैदानिक ​​सुविधाओं और जीएम धनात्मकता की वजह से दोनों 2002 और 2008 के दिशा निर्देशों के तहत संभावित 'आइए साथ का निदान किया गया. ध्यान दें, जबकि न तो LFD न ही पीसीआर assays के वर्तमान EORTC / MSG के दिशा निर्देशों में शामिल कर रहे हैं, वहाँ दो assays और वाणिज्यिक galactomannan परीक्षण बाल नमूना में Aspergillus प्रतिजन और न्यूक्लिक एसिड की उपस्थिति का संकेत के बीच मजबूत समझौता है कि 6 और 12 रोगियों की है. आईपीए के निदान में LFD और पीसीआर assays की प्रभावकारिता का प्रदर्शन परीक्षण के अतिरिक्त परिणाम जॉनसन एट अल 8 में पाया जा सकता है. चित्रा 1 (केवल नियंत्रण रेखा) नकारात्मक और सकारात्मक (नियंत्रण और परीक्षण लाइन) LFD सीरम और बाल का उपयोग कर परीक्षण के परिणाम है. परीक्षण लाइन प्रतिक्रियाओं की तीव्रता सीरम और बाल के नमूने में लक्ष्य प्रतिजन की सांद्रता के आनुपातिक हैं. प्रतिक्रियाओं आमतौर पर रेंज से कमजोर (+) मध्यम के माध्यम से (+) को मजबूत (+). परीक्षण लाइन तीव्रता के बावजूद, सभी तीन सीरम सकारात्मक प्रतिक्रिया इनवेसिव फेफड़े aspergillosis Aspergillus प्रतिजन खून में परिसंचारी की उपस्थिति के कारण रोग का संकेत होगा. सकारात्मक बाल प्रतिक्रियाओं (कमजोर, मध्यम या मजबूत) spores और संभावित फेफड़ों में रोगजनक hyphae के विकास के अंकुरण का संकेत होगा. सहायता "pdflinebreak> रोगी नहीं. पतिईएनटी जानकारी नैदानिक ​​1 मानदंडों बाल 2 संस्कृति जीएम ईआईए सूचकांक 3 EORTC / MSG (2002) 4 EORTC / MSG (2008) 5 Aspergillus पीसीआर नतीजे LFD परिणाम 6 – प्रमुख सीटी संकेत (गुत्थी और प्रभामंडल) और एक मामूली नकारात्मक 0.9 (सकारात्मक) संभावित संभावित सकारात्मक सकारात्मक कमजोर (+) 12 प्रकल्पित पिछले कवक संक्रमण नहीं प्रमुख, छोटे से एक Candida glabrata 6.43 (मजबूत सकारात्मक) संभव कोई नहीं सकारात्मक मजबूत सकारात्मक (+ +) 13 कोई भी एंजाइम को स्कंदन करता है अर्थात जमाता है – नकारात्मक Staphylococcus और ई. खून में कोलाई नहीं प्रमुख, दो नाबालिग नकारात्मक 0.25 (नकारात्मक) संभव कोई नहीं नकारात्मक (-) नकारात्मक 16 सीने में संक्रमण 3 नए घुसपैठ से अधिक बहुवचन बहाव सहित नाबालिग मापदंड नकारात्मक 0.16 (नकारात्मक) संभव कोई नहीं नकारात्मक (-) नकारात्मक 1 टोमोग्राफी स्कैन पर पिंड या halos कवक संक्रमण के विचारोत्तेजक है 2 बाल द्रव में Candida glabrata एक contaminant के रूप में माना जाएगा के रूप में यह दूसरा सबसे आम खमीर सामान्य मानव 9 वनस्पति के भाग के रूप में अलग है 3 बाल के जीएम ईआईए परीक्षण में 0.8> का एक सूचकांक Aspergillus संक्रमण का संकेत है 4 possibl के लिए 2002 / EORTC MSG के नैदानिक ​​मानदंडों के आधार परई 'है,' संभावित 'या' साबित 'इनवेसिव कवक 10 रोग 5 संशोधित (2008) के लिए 'संभव' EORTC / MSG के नैदानिक ​​मानदंड, 'संभावित' या 'साबित' इनवेसिव कवक 2 रोग पर आधार तालिका 1 BAL नमूनों की संभावित आईपीए और नियंत्रण एएमएल रोगियों (संक्रमण के कोई सबूत नहीं है) से तीव्र myeloid लेकिमिया रोगियों से LFD परीक्षण, और संक्रमण के निदान / EORTC MSG के परिणाम.

Discussion

आइपीए की निश्चित पहचान बायोप्सी नमूनों से etiologic एजेंट के अलगाव से ही सही मायने में हासिल किया जा सकता है, लेकिन उपयुक्त नमूनों की वसूली बहुत बीमार रोगियों में अक्सर है और संभव नहीं Aspergillus शायद ही कभी रक्त से वसूली योग्य है. हालांकि प्रमुख अग्रिमों गणना tomographic का उपयोग आइपीए निदान में छाती की स्कैनिंग में बनाया गया है, लक्षण है कि "हेलो" या "हवा – वर्धमान" संकेत के रूप में फेफड़े के आईपीए के सूचक हैं या तो क्षणिक हैं या साँस लेने में कलाकृतियों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है या अन्य कवक संक्रमण ^11,12. इस तरह के डेटा इसलिए सीरम वैज्ञानिक तकनीक है कि कवक है कि रोगी के सीरम में घूम रहे हैं या कि बाल तरल पदार्थ, थूक या मूत्र के ¹³ नमूने में मौजूद हैं से हस्ताक्षर अणुओं (जीएम और β-glucan) की पहचान के उद्देश्य के साथ पूरक हैं. जबकि इन परीक्षणों को संतोषजनक संवेदनशीलता प्रदर्शित करते हैं, वे पर्याप्त विशिष्टता की कमी है या कुछ ^1,6 की शर्तों के तहत हस्तक्षेप से पीड़ित </sup>.

LFD आइपीए का पता लगाने के लिए परीक्षण यहाँ प्रस्तुत आईपीए और शोषण प्रौद्योगिकी है कि वायरस, जीवाणु, परजीवी और विषाक्त पदार्थों को ^14-19 का पता लगाने के लिए परीक्षण में तारीख और, सबसे मशहूर इस्तेमाल किया गया है के बिंदु की देखभाल निदान के लिए सक्षम बनाता है, घर गर्भावस्था के लिए पहली बार 1988 में द्वारा शुरू परीक्षण Unipath. Aspergillus यहाँ वर्णित LFD में, Aspergillus – विशिष्ट एमएबी JF5 के एक झरझरा nitrocellulose झिल्ली पर कब्जा क्षेत्र परीक्षण (लाइन) के लिए स्थिर है. विरोधी माउस एक अलग क्षेत्र में झिल्ली को स्थिर इम्मुनोग्लोबुलिन एक आंतरिक नियंत्रण (नियंत्रण रेखा) के रूप में सेवा की. सीरम या बाल तरल पदार्थ की रिहाई बंदरगाह के अलावा, एमएबी JF5 रिहाई पैड में कोलाइडयन सोने लक्ष्य प्रतिजन के लिए संयुग्म बांधता है और जटिल तो केशिका कार्रवाई द्वारा झरझरा झिल्ली के साथ गुजरता है. एमएबी JF5 कब्जा क्षेत्र में स्थिर JF5 कोलाइडयन सोने – प्रतिजन एक लाल परीक्षण लाइन में जिसके परिणामस्वरूप जटिल करने के लिए बांधता है. किसी भी अपार JF5 – कोलाइडयन सोनासंयुग्म आंतरिक नियंत्रण का संकेत है कि परख सही ढंग से चलाने की है करने के लिए बांधता है. एक लाल नियंत्रण रेखा में यह परिणाम है.

परीक्षण त्वरित है, केवल 15 मिनट लेने के लिए प्रदर्शन, सीरम और बाल जीएम और β-glucan का पता लगाने के आधार पर परीक्षण की तुलना में सस्ता है, और महंगे उपकरण या व्यापक प्रयोगशाला सुविधाओं को चलाने की आवश्यकता नहीं है. इसके अलावा, एमएबी JF5 दिखाया गया है कि जीएम और β-glucan ^1,4,6 परीक्षण में झूठी सकारात्मक प्रतिक्रिया के कारण दवाओं या contaminants के साथ पार प्रतिक्रिया नहीं करता है. वर्तमान नैदानिक ​​परीक्षणों में एक अतिरिक्त प्रमुख लाभ LFDs गतिविधि कि आक्रामक Aspergillus प्रजातियों के विकास का संकेत है का पता लगाने की क्षमता है.

LFD प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम के परिणाम सीरम या BAL नमूना के उपकरण के लिए आवेदन के बाद 15 मिनट पढ़ने की जरूरत है. परीक्षण के परिणाम की रिकॉर्डिंग से पहले अब से 15 मिनट के लिए नहीं यह पूर्वाग्रह परिणाम interpretati के रूप में छोड़ दिया जाना चाहिए,पर. एक कमजोर प्रतिक्रिया ऊष्मायन अवधि के विस्तार से नहीं बढ़ाया जाएगा. गर्मी उपचार के संक्रमण के पशु मॉडल से सीरम परख संवेदनशीलता में सुधार पाया गया है. परीक्षण की एक सीमा है कि यह गुणात्मक है, और ऑपरेटर धनात्मकता की एक व्यक्तिपरक आकलन पर निर्भर करता है. सीरम और बाल के नमूने (चित्रा 1) के प्रतिजन सामग्री के लिए परीक्षण लाइन की तीव्रता के अनुसार बदलता रहता है. हालांकि, किसी भी सकारात्मक प्रतिक्रिया (ज्ञात नकारात्मक करने के लिए तुलना द्वारा निर्धारित) Aspergillus प्रतिजन और इसलिए संक्रमण की उपस्थिति का संकेत है. LFD assays के आत्मीयता सीमा, हाथ से आयोजित डिवाइस उपलब्ध हैं जो LFD परीक्षण लाइन तीव्रता की मात्रा का ठहराव की अनुमति और प्रतिजन ²⁰ का पता लगाने के लिए सीमा मान की स्थापना सक्षम.

LFD के भविष्य के घटनाक्रम इसके व्यावसायीकरण और एक मल्टीप्लेक्स LFD का विकास है कि अन्य इनवेसिव कवक रोगजनकों के साथ पता लगाने की अनुमति देता हैअत्यधिक विशिष्ट Mabs ³ का उपयोग कर.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Aspergillus LFD	University of Exeter		Available from the corresponding author on request
RPMI-1640	Sigma	R0883
L-Glutamine	Sigma	G7513
Fetal calf serum	Biosera	S9100	Other sources of fetal calf serum can be used in the preparation of TCM
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1